Identifizierung und Charakterisierung der Dihydropyridinbindungsstelle am L-Typ-Kalziumkanal:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1996
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| adam_text | DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND
PHARMAZIE DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN IDENTIFIZIERUNG UND
CHARAKTERISIERUNG DER DIHYDROPYRIDINBINDUNGSSTELLE AM L-TYP KALZIUMKANAL
VON ANGELA SCHUSTER AUS GENF 1996 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS
SEITE ABKUERZUNGEN V A. EINLEITUNG L B. MATERIAL UND METHODEN LOE 1.
ORGANISMEN UND VEKTOREN 10 1.1 BAKTERIEN 10 .1.1 EINGESETZTE STAEMME 10 .
1.2 NAEHRMEDIEN UND ANTIBIOTIKA 10 .1.3 KULTIVIERUNG 11 1.2
EUKARYONTISCHE ZELLEN 12 1.2.1 VERWENDETE ZELLINIEN 12 .2.2 NAEHRMEDIEN .
12 .2.3 ZUSAETZE 12 .2.4 ZELLKULTUR 14 1.3 VEKTOREN 16 1.3.1 VERWENDETE
PLASMIDE * 17 2. METHODEN ZUR ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN 20 2.1 REINIGUNO UND QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 20
2.1.1 PRAEZIPITATION VON NUKLEINSAEUREN 20 2.1.2 EXTRAKTION VON
NUKLEINSAEUREN MIT PHENOL/CHLOROFORM-MISCHUNGEN 20 2.1.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN 21 2.2
GELELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG UND GEWINNUNG VON DNS-FRAGMENTEN 21 2.2.1
LOESUNGEN 21 2.2.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 22 2.2.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 22 2.2.4 ISOLIERUNG EINZELNER
NUKLEINSAEUREFRAGMENTE MITTELS ELEKTROELUTION 23 2.3 ISOLIERUNG VON
PLASMID-DNS * 24 2.3.1 SCHNELLISOLIERUNG VON PLASMID-DNS NACH HOLMES UND
QUIGLY (1981) 24 2.3.2 PLASMIDISOLIERUNG UND REINIGUNG MITTELS
SAEULENCHROMATOGRAPHIE 25 2.4 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNS-MOLEKUELEN
26 2.4.1 SPALTUNG VON DNS-MOLEKUELEN MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 26
2.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNS-MOLEKUELEN MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE
28 2.4.3 VERKNUEPFUNG VON DNS-FRAGMENTEN MIT T4-DNS-LIGASE 29 2.5
SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 29 2.5.1 HERSTELLUNG DURCH AUTOMATISCHE
FESTPHASENSYNTHESE 29 2.5.2 REINIGUNG DURCH
UMKEHR-PHASEN-CHROMATOGRAPHIE 30 2.6 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNS NACH
DER DIDESOXY-METHODE 30 2.6.1 DENATURIERUNG VON PLASMID-DNS 31 2.6.2
AUSWAHL DER PRIMER 31 2.6.3 SEQUENZREAKTION 32 2.6.4 DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE UND AUTORADIOGRAPHIE 33 2.6.5
BESEITIGUNG VON KOMPRESSIONEN 34 INHALTSVERZEICHNIS 2.7 PGR-GESTUETZTE
AMPLIFIZIERUNG UND KLONIERUNG SPEZIFISCHER DNS-FRAGMENTE 34 2.7.1
THEORIE UND ANWENDUNG DER POLYMERASEKETTENREAKTION 34 2.7.2
STANDARDPROTOKOLL DER PCR 35 2.8 KONSTRUKTION REKOMBINANTER PLASMIDE
37 3. TRANSFEKTIONSMETHODEN 39 3.1 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 39 3.1.1
PRAEPARATION KOMPETENTER BAKTERIENZELLEN 39 3.1.2 TRANSFORMATION VON E.
COLI 4 0 3.2 TRANSFEKTION VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN 41 3.2.1
KALZIUM-PHOSPHAT-METHODE 41 3.2.2 LIPOFEKTION 42 3.2.3 ERSTELLEN VON
STABILEN ZELLINIEN MITTELS ELEKTROPORATION 43 4. ISOLIERUNG UND
CHARAKTERISIERUNG VON PROTEINEN 45 4.1 MEMBRANPRAEPARATION 45 4.1.1
PROTEASEINHIBITOREN 46 4.1.2 LOESUNGEN 46 4.1.3 DURCHFUEHRUNG 46 4.2
BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 47 4.2.1 LOESUNGEN . 47 4.2.2
DURCHFUEHRUNG 47 4.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 48 4.3.1
LOESUNGEN 48 4.3.2 HERSTELLUNG DER SDS-POLYACRYLAMIDGELE 50 4.3.3
PROBENVORBEREITUNG UND ELEKTROPHORESE 50 4.4 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION
DURCH WESTERN-BLOT 50 4.4.1 VERWENDETE ANTIKOERPER 51 4.4.2 LOESUNGEN 51
4.4.3 PROTEIN-TRANSFER DURCH SEMIDRY-BLOTTING MIT DISKONTINUIERLICHEM
PUFFERSYSTEM 52 4.4.4 IMMUNFAERBUNG 52 5. BINDUNG EINES SPEZIFISCHEN
LIGANDEN 53 5.1 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN BINDUNG VON RADIOAKTIV
MARKIERTEM ISRADIPIN AN GEREINIGTE MEMBRANEN 53 5.1.1 LOESUNGEN 53 5.1.2
DURCHFUEHRUNG 54 6. ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 55 6.1
GRUNDLAGEN UND DURCHFUEHRUNG 55 6.1.1 VERWENDETE LOESUNGEN 55 6.2
MESSPROTOKOLLE 56 6.2.1 STROM-SPANNUNGS-BEZIEHUNG 56 6.2.2
STEADY-STATE-INAKTIVIERUNG 56 6.2.3 DOSIS-WIRKUNGSKURVEN 56
INHALTSVERZEICHNIS HI C. ERGEBNISSE 52 7. CHARAKTERISIERUNG DER FUER DIE
DIHYDROPYRIDINWECHSELWIRKUNG ENTSCHEIDENDEN REGION. 57 7.1 VERWENDETE
KALZIUMKANAL-UNTEREINHEITEN 57 7.1.1 A, UNTEREINHEITEN 57 7.1.2. (I,
UNTEREINHEIT 59 7.1.3 O 2 /6 UNTEREINHEIT 59 7.2 KONSTRUKTION,
EXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DER CHIMAEREN 4-20 59 7.2.1
SUBKLONPT7CL* 59 7.2.2 EXPRESSIONSPLASMID A,C B IN PCDNA3* 59 7.2.3
CHIMAEREN 4-8 60 7.2.4 CHIMAEREN 9-11 66 7.2.5 CHIMAEREN 12-14 68 7.2.6
CHIMAEREN 16-18 68 7.2.7 CHIMAEREN 15, 19 UND 20 69 7.3 ZUSAMMENFASSENDE
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE BESCHREIBUNG DER ENTSCHEIDENDEN CHIMAEREN 4,11,15
UND 20 70 8. IDENTIFIZIERUNG DER DIHYDROPYRIDINBINDUNGSSTELLE AUF
AMINOSAEUREEBENE 73 8.1 KONSTRUKTION UND EXPRESSION DER CHIMAEREN 17, 18
UND 21-31 73 8.2 LOKALISATION DER FUER DEN HOCHAFFINEN ISRADIPIN-BLOCK
VERANTWORTLICHEN AMINOSAEUREN 74 8.3 DIE MUTATION VON DREI AMINOSAEUREN
ENTFERNT DHP-INTERAKTIONSSTELLE 76 8.4 STIMULATION DURCH BAY K 8644 78
8.5 ANDERE KALZIUMANTAGONISTEN - 79 9. INVERSE CHIMAEREN 82 9.1
KONSTRUKTION DER INVERSEN CHIMAEREN 82 9.2 EXPRESSION UND
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER INVERSEN CHIMAEREN 86 10. STABILE
EXPRESSION, ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER KALZIUMKANALPROTEINE 86
10.1 STABILE EXPRESSION DER A, UND SSN UNTEREINHEIT IN HEK 293 ZELLEN. 86
10.2 ISOLIERUNG DER KALZIUMKANALPROTEINE UND IDENTIFIZIERUNG MITTELS
SPEZIFISCHER ANTIKOERPER. 87 10.3 BINDUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEM
ISRADIPIN AN DIE A, UNTEREINHEIT DES KALZIUMKANALS. 89 P. DISKUSSION 20.
11. DIE DIHYDROPYRIDINBINDUNGSSTELLE 90 11.1 GEMEINSAME BINDUNGSREGION
DER KALZIUMKANALANTAGONISTEN AM L-TYP KALZIUMKANAL 90 11.2 DIE
NIEDERAFFINE DIHYDROPYRIDINBINDUNGSSTELLE 95 11.3 EINFUEHRUNG DER
DIHYDROPYRIDINBINDUNGSSTELLE IN DEN DHP-INSENSITIVEN R-TYP KALZIUMKANAL
96 IV INHALTSVERZEICHNIS E. ZUSAMMENFASSUNG SS 12. DIE BINDUNGSSTELLEN
DER KALZIUMANTAGONISTEN UND AGONISTEN 98 F. ANHANG 22 13. ERLAEUTERUNGEN
ZU AMINOSAEUREN, OLIGONUKLEOTIDEN, SEQUENZEN UND SUBSTANZEN 99 13.1
KURZSCHREIBWEISE DER AMINOSAEUREN 99 13.2 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 100
13.3 AMINOSAEURESEQUENZ DER 13.4 ALPHABETISCHE FIRMENLISTE 106 G.
LITERATURVERZEICHNIS UEB 14. VEROEFFENTLICHUNGEN 108 14.1 ZITIERTE
VEROEFFENTLICHUNGEN 108 14.2 EIGENE VEROEFFENTLICHUNGEN 117
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