Identifizierung und Charakterisierung von SIMP1, einem sehr kleinen Gen mit einer Funktion beim mitochondrialen Proteintransport der Hefe Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 98 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
5
2
1
MATERIAL
5
2.1
1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
5
2.1
2
STAEMME
UND
MEDIEN
6
2.1.3
PLASMIDE
8
2.1.4
GENBANK
9
2.2
METHODEN
9
2.2.1
TRANSFONNATION
VON
HEFE
9
2.2.2
PLASMIDISOLATION
AUS
HEFE
9
2.2
3
ISOLATION
VON
HEFE-GESAMT-DNA
10
2.2
4
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
10
2
2.5
PLASMIDISOLATION
AUS
E.COLI
10
2.2
6
INFEKTION
VON
E.COLI
MIT
ML3-PHAGEN
11
2.2.7
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGERM13-DNA
11
2.2.8
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
12
2.2.9
RESTRIKTION
VON
DNA
12
2
2.10
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
12
2.2
11
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
13
2.2
12
KLONIERUNG
VON DNA
13
2.2.12.1
VORBEHANDLUNG
VON
VEKTOREN
UND
DNA-FRAGMENTEN
FUER
DIE
KLONIERUNG
13
2.2.12.2
LIGATION
13
2
2
12.3
EXONUKLEASE
HI-VERKUERZUNG
VON
DNA
14
2.2.13
HERSTELLEN
VON
PUNKTMUTATIONEN
DURCH
M
VITRO
MUTAGENESE
14
2
2
14
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
14
2.2.15
SOUTHERN-BLOT
15
2.2
15.1
MARKIERUNG
VON
DNA-UND
RNA-SONDEN
15
2.2
15.2
TRANSFER
DER
DNA
AUF
MEMBRANEN
15
2.2.15.3
HYBRIDISIERUNG
16
2.2.15.4
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
16
2.2.16
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
17
2.2.17
ISOLATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEFE
17
2.2.18
REINIGUNG
VON
POLY(A)
+
RNA
18
2.2.19
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
18
2.2.20
NORTHERN-BLOT
19
2.2.21
IN
VITRO
TRANSCRIPTION
19
2.2.22
SL-MAPPING
19
2.2.23
ISOLATION
VON
GESAMTPROTEIN
AUS
HEFE
20
2.2.24
ISOLATION
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
HEFE
20
2.2.25
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MITOCHONDRIALER
TRANSLATIONSPRODUKTE
21
2.2.26
SDS-PAGE
VON
PROTEINEN
22
2.2.27
WESTERN-BLOT
23
2.2.28
KREUZUNG
VON
HEFE
24
2.2.29
SPORULATION
UND
TETRADENANALYSE
24
2.2.30
HERSTELLUNG
VON
P-HEFE
25
2.2.31
KRYOKONSERVIERUNG
VON
HEFESTAEMMEN
25
2.2.32
CYTOCHROMOXIDASE-TEST
25
2.2.33
PLATTENTEST
AUF
PROTEASE
B
-AKTIVITAET
25
3.
ERGEBNISSE
26
3.1
ANALYSE
DER
IMP
1
-MUTANTEN
PET
TS2858,
PET
TS
1541
UND
8/3-16
26
3.1.1
MUTANTENPHAENOTYPE
27
3.1.2
ISOLATION
DER
MUTANTENALLELE
27
3.1.3
SEQUENZANALYSE
29
3.2
ISOLIERUNG
EINES
SUPPRESSORS
FUER
DIE
MUTANTE
PET
TS2858
32
3.2.1
KOMPLEMENTATION
DER
PET
TS2858-MUTANTE
32
3.2.2
SEQUENZIERUNG
DER
KOMPLEMENTIERENDEN
REGION
33
3.2.3
SUBKLONIERUNG
UND
KOMPLEMENTATIONSANALYSE
37
3.2.4
TEST
AUF
SUPPRESSION
WEITERER
PET-MUTANTEN
MIT
COX2
PROZESSIERUNGSDEFEKT
37
3.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
HIGH
COPY
SUPPRESSORS
38
3.3.1
GENDISRUPTION
38
3.3.1.1
DELETION
VON
RF306
39
3.3.1.2
HERSTELLUNG
DER
DELETIONSMUTANTE
A3
39
3.3.1.3
HERSTELLUNG
EINES
A3-DELETIONSSTANUNES
MIT
DEM
TRPL-MARKER
DURCH
TETRADENANALYSE
41
3.3.1.4
KOMPLEMENTATION
DER
A3-DELETION
44
3.3.1.5
DELETION
DER
GENE
PCM1
UND
PRB1
46
3.3.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
PHAENOTYP
DER
DELETIONSMUTANTE
A3
48
3.3.2.1
CYTOCHROMOXIDASE
TEST
48
3.3.2.2
PROZESSIERUNG
VON
COX2
48
3.3.2.3
ANALYSE
DES
CYTBJ
50
3.3.3
TRANSCRIPTANALYSE
51
3.3.3.1
NORTHERN
ANALYSE
51
3.3.3.2
ASSOZIATION
DER
SIMP1-RNA
MIT
DEN
MITOCHONDRIEN
54
3.3.3.3
KARTIERUNG
DES
SIMPL-TRANSCRIPTES
55
3.3.3.3.1
KARTIERUNG
MIT
NUKLEASESL
55
3.3.3.3.2
YYSCREENING
"
DER
CDNA-BANKEN
57
3.3.3.3.3
PCR-AMPLIFIKATION
UND
ANSEQUENZIERUNG
EINES
CDNA-KLONS
58
3.3.4
MUTATIONSANALYSE
DES
SUPPRESSORGENS
60
3.3.4.1
EINFUHREN
VON
TERMINATIONSCODONS
DURCH
IN
VITRO
MUTAGENESE
61
3.3.4.2
EINFUHREN
VON
DELETIONEN
UND
YYFRAMESHIFT
"
-MUTATIONEN
DURCH
IN
VITRO
MUTAGENESE
64
3.3.4.3
MUTAGENESE
DER
START-CODONS
64
3.3.4.4
KOMPLEMENTATIONSTEST
65
3.3.4.4.1
ANALYSE
DER
KONSTRUKTE
IN
HOHER
KOPIENZAHL
66
3.3.4.4.2
ANALYSE
DER
KONSTRUKTE
IN
NIEDRIGER
KOPIENZAHL
68
3.3.5
MOLEKULARE
ORGANISATION
DER
SIMP1-GENREGION
70
3.3.5.1
AUSWERTUNG
DER
ABGELEITETEN
PROTEINSEQUENZ
70
3.3.5.2
CODON
GEBRAUCH
72
3.3.5.3
DIE5'-REGION
72
3.3.5.4
DIE3'-REGION
74
4.
DISKUSSION
76
5
ZUSAMMENFASSUNG
87
6.
LITERATURVERZEICHNIS
89
DANKSAGUNG |
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