Adenylosuccinat-Synthetase und MRF1-Protein-Charakterisierung zweier sequenzspezifischer Einzelstrang-DNA-Bindungsproteine aus Saccharomyces cerevisiae:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
|
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
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0.
INHALTSVERZEICHNIS
I
0.
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.VII
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
ALLGEMEINE
EINFUEHRUNG
.
1
1.2.
DNA-REPLIKATION
UND
DIE
AN
IHR
BETEILIGTEN
ZELLULAEREN
FAKTOREN
.
1
1.3.
DER
ZELLZYKLUS
UND
SEINE
REGULATION
.
5
1.4.
REPLIKATIONSSTARTPUNKTE
BEI
EUKARYONTEN
UND
REGULATION
IHRER
AKTIVITAET
.
6
1.5.
ARS-ELEMENTE
-
DIE
STARTPUNKTE
DER
DNA-REPLIKATION
BEI
SAC
CHAROMYCES
CEREVISIAE
.
8
1.6.
INITIATION
DER
REPLIKATION
AM
BEISPIEL
VON
E.COLI
UND
SV40-VIRUS
.
10
1.7.
POTENTIELLE
INITIATORPROTEINE
BEI
SXEREVISIAE
.
13
1.8.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
15
2.
MATERIALIEN
.
16
2.1.
NAEHRMEDIEN
.
16
2.2.
HEFE
UND
BAKTERIENSTAEMME
.
16
2.3.
PLASMIDE
.
17
2.4
PUFFER
.
17
2.4.1.
PUFFER
FUER
DIE
PROTEINREINIGUNG
AUS
S.
CEREVISIAE
.
17
2.4.2.
PUFFER
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
18
2.4.3.
SONSTIGE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
18
2.5.
ENZYME
UND
PROTEINE
.
18
2.6.
CHEMIKALIEN
.
19
2.6.1.
CHROMATOGRAPHIEMATERIALIEN
FUER
DIE
PROTEINREINIGUNG
.
19
2.6.2.
RADIOCHEMIKALIEN
.
19
2.6.3.
ALLGEMEINE
CHEMIKALIEN
.
20
2.6.4.
SONSTIGES
.
20
2.7.
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
20
2.7.1.
GELRETARDATIONSTESTS
.
21
2.7.2.
PHOTOCROSSLINKING-EXPERIMENTE
.
21
2.7.3.
SEQUENZIERUNG
DES
AS-GENS
AUS
DEM
MUTANTEN
HEFESTAMM
Y241
.
22
N
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.4.
PCR-PRIMER
ZUR
GEWINNUNG
N
BZW.
C-TERMINALER
FRAGMENTE
DES
AS-GENS
FUER
DIE
KNOCKOUT-MUTAGENESE
IN
S.CEREVISIAE
.
22
2.7.5.
PCR-REAKTIONEN
ZUR
GEWINNUNG
EINES
144
BP
ABSCHNITTES
AUS
DEM
ARS
1
-ELEMENT
IN
DOPPELSTRAENGIGER
BZW.
EINZELSTRAENGIGER
FORM.
22
3.
METHODEN
.
23
3.1.
PRAEPARATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
S.CEREVISIAE
.
23
3.1.1.
GEWINNUNG
VON
BJ926
BZW.
Y241
HEFEZELLEN
DER
SPAETLOGARITH
MISCHEN
WACHSTUMSPHASE
DURCH
ANZUCHT
IM
501
FERMENTER
.
23
3.1.2
KUGELMUEHLENAUFSCHLUSS
VON
HEFEZELLEN
DER
SPAETLOGARITH
MISCHEN
WACHSTUMSPHASE
BZW.
VON
KOMMERZIELLER
BAECKERHEFE,
DIE
UEBER
NACHT
AKTIVIERT
WORDEN
WAR
.
24
3.2.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
25
3.2.1.
CHROMATOGRAPHIE
IM
BATCHVERFAHREN
.
25
3.2.2.
FPLC-GESTUETZTE
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
25
3.3.
GELELEKTROPHORETISCHE
STANDARDMETHODEN
.
26
3.3.1.
NATIVE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
26
3.3.2.
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
26
3.3.2
1
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
MIT
8,3
M
HARNSTOFF
ZUR
AUFTRENUNG
VON
DNA-SEQUENZIERUNGSPRODUKTEN
.
27
3.3.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
NACH
LAEMMLI
.
28
3.3.4.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
NACH
SCHAEGGER
UND
JAGOW
.
28
3.3.5.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
IM
DISKONTINUIERLICHEN
GELSYSTEM
.
29
3.3.6.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
29
3
3.6.1.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
30
3.3.6.2.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
30
3.3.7.
SICHTBARMACHUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
GELFAERBUNG
.
31
3.3.8.
AGAROSE
GELELEKTROPHORESE
.
31
3.4.
CHARAKTERISIERUNG
VON
ENZYMEIGENSCHAFTEN
.
32
3.4.1.
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
ADENYLO
SUCCINAT-SYNTHETASE
(AS)-AKTIVITAET
.
32
3.4.1.1
OPTISCHER
TEST
.
32
3.4.1.2.
MESSUNG
DER
ASPARTAT-ABHAENGIGEN
GTP-HYDROLYSE
("GTPASE-TEST").
32
3.4.2.
GELRETARDATIONSANSAETZE
.
33
3.4.3.
ANALYTISCHE
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
34
3.4.4.
BESTIMMUNG
DER
K^-WERTE
.
34
3.4.5.
BESTIMMUNG
DER
KJ-WERTE
.
34
0.
INHALTSVERZEICHNIS
M
3.4.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
DER
DEPHOSPHORYLIERUNG
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
35
3.4.7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
DER
AS
UND
DEM
DNA-POLYMERASE
A-PRIMASE-KOMPLEX
AUS
SAEUGERZELLEN
.
35
3.4.7.1.
POLYMERASE
A-AKTIVITAETSTEST
.
36
3.7.4.2.
DNA-SYNTHESE
AUF
EINZELSTRANG-ML3-DNA
.
36
3.4.7
3.
SV40-REPLIKATION
IN
VITRO
.
36
3.4.7.4.
SV40-INITIATION
IN
VITRO
.
37
3.4.7.5.
DNA-REPLIKATION
AUF
ACS-HALTIGER
SSARS
1
-MATRIZE
.
38
3.5.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
.
38
3.5.1.
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
VON
DNA
.
38
3.5.2.
PLASMIDISOLIERUNG
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
(BOILINGPREP)
.
39
3.5.3.
PLASMIDISOLIERUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
.
40
3.5.4.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
S.CEREVISIAE
.
40
3.5.5.
ISOLIERUNG
EINZELSTRAENGIGER
M13-DNA
.
41
3.5.6.
ELEKTROELUTION
.
41
3.5.7.
SOUTHERN-BLOT
.
42
3.6.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
42
3.6.1.
5
-PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGODESOXYNUKLEOTIDENMITY-[32P]-ATP.
42
3.6.2.
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
43
3.6.3.
DEPHOSPHORYLIERUNG
.
43
3.6.4.
LIGATION
.
44
3.6.5.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
44
3.6.6.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
46
3.6.7.
MARKIERUNG
DER
URA3-SONDE
MIT
DIGOXYGENIN
.
46
3.7.
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
IN
BAKTERIEN
UND
HEFEN
.
47
3.7.1.
HERSTELLUNG
CAC12-KOMPETENTER
E.COLI
XLL-BLUE-ZELLEN
.
47
3.7.2.
TRANSFORMATION
VON
CAC12-KOMPETENTEN
E.COLI
XLL-BLUE-ZELLEN
.
47
3.7.3.
HERSTELLUNG
VON
ELEKTROPORATIONS-KOMPETENTEN
S.CEREVISIAE
W303-LB-ZELLEN
.
48
3.7.4.
ELEKTROPORATION
VON
5.
CEREVISIAE
W303
IB-ZELLEN
.
48
3.8.
QUERVERNETZUNGSEXPERIMENTE
MIT
OLIGONUKLEOTIDEN,
DIE
5-IODDES
OXYURIDIN-SUBSTITUTIONEN
IN
DER
ACS
TRUGEN
.
49
3.8.1.
SPEKTROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHOTOREAKTIVITAET
VON
5-IODDESOXYURIDIN
.
49
3.8.2.
QUANTITATIVE
ANALYSE
LODDESOXYURIDIN-SUBSTITUIERTER
OLIGONUK
LEOTIDE
MIT
HILFE
DER
HPLC-ANALYTIK
.
49
3.8.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
PHOTOCROSSLINKING-REAKTIONEN
.
50
3.9.
PROTEINSEQUENZIERUNG
.
50
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.10.
HOMOLOGIE-MODELLIERUNG
DER
STRUKTUR
DER
AS
AUS
SXEREVISIAE
MIT
HILFE
DER
ROENTGENKRISTALLSTRUKTUR-DATEN
FUER
DIE
AS
AUS
E.COLI
.
50
3.11.
STANDARDMETHODEN
.
51
3.11.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
PROTEINEN
.
51
3.11.2.
MESSUNG
DER
RADIOAKTIVITAETS-EINBAURATEN
DURCH
TCA-FAELLUNG
.
52
4.
ERGEBNISSE
.
53
4.1.
REINIGUNG
DES
45
KD
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINS
.
53
4.1.1.
GEWINNUNG
EINES
PROTEINHALTIGEN
S
1
OO-UEBERSTANDES
AUS
S.
CEREVISIAE
.
53
4.1.2.
UEBERBLICK
UEBER
DIE
CHROMATOGRAPHISCHEN
REINIGUNGSCHRITTE
DER
ADENYLOSUCCINAT-SYNTHETASE
ZUR
HOMOGENITAET
.
54
4.2.
IDENTIFIZIERUNG
DES
40
KD
SSARS-T
BINDUNGSPROTEINS
ALS
MRF1
PROTEIN
UND
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DESSEN
DNA-BINDUNGSAKTIVITAET
.
62
4.2.1.
REINIGUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
DES
40
KD
SSARS-T-BINDUNGSPRO
TEINS
.
62
4.2.2.
VERGLEICH
DER
BEIDEN
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
AUS
S.CEREVISIAE
HINSICHTLICH
IHRER
ACS-BINDUNGSSPEZIFITAET
.
64
4.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ENZYMATISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DER
ADENYLOSUCCINAT-SYNTHETASE
AUS
S.CEREVISIAE
.
68
4.3.1.
QUALITATIVE
UND
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
DER
AS
.
69
4.3.1.1.
OPTISCHER
TEST
.
69
4.3.1.2.
GTPASE-TEST
.
69
4.3.2.
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
.
70
4.3.3.
EINFLUSS
DER
SALZKONZENTRATION
AUF
DIE
EIGENSCHAFTEN
DER
AS
.
71
4.3.4.
K
M
-WERTE
DER
SUBSTRATE
DER
ENZYMKATALYSIERTEN
REAKTION
.
72
4.3.5.
BESTIMMUNG
DER
KJ-WERTE
VON
AMP,
GMP,
GDP
UND
ADENYLOSUCCINAT
.
73
4.3.6.
ANALYTISCHE
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
ZUR
BESTIMMUNG
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTES
DER
AS
.
74
4.4.
WECHSELSEITIGER
EINFLUSS
VON
ENZYMAKTIVITAET
UND
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFT
DER
AS
AUS
SXEREVISIAE
.
75
4.4.1.
EINFLUSS
DER
SUBSTRATE
DER
AS-KATALYSIERTEN
REAKTION
AUF
DIE
DNA
BINDUNGSAKTIVITAET
DER
AS
.
75
4.4.2.
EINFLUSS
DER
DNA-BINDUNG
AUF
DIE
AS-AKTIVITAET
.
77
4.4.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
BEOBACHTETEN
HEMMEFFEKTES
.
78
0.
INHALTSVERZEICHNIS
V
4.4.4.
ABHAENGIGKEIT
VON
DNA-BINDUNG
UND
ASPARTAT-ABHAENGIGER
GTP-HYDROLYSE
VOM
PHOSPHOIYLIERUNGSSTATUS
DER
AS
.
79
4.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTIONALEN
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
DEN
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINEN
UND
DEM
DNA-POLYMERASE
A
PRIMASE
KOMPLEX
AUS
HOEHEREN
EUKARYONTEN
.
84
4.5.1.
EINFLUSS
DER
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
DNA-POLYMERASE
A
.
85
4.5.2.
EINFLUSS
DER
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
AUF
DIE
DE
NOVO
SYNTHESE
NICHT
GEPRIMTER
M13-SSDNA
.
86
4.5.3.
EINFLUSS
DER
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
AUF
DIE
DNA-REPLIKATION
IM
SV40
IN
VITRO
REPLIKATIONSSYSTEM
.
87
4.5.4.
EINFLUSS
DER
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
AUF
DIE
INITIATION
DER
SV40-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
.
88
4.5.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHYSIKALISCHEN
UND
FUNKTIONALEN
WECHSEL
WIRKUNG
ZWISCHEN
DEN
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINEN
UND
DER
DNA-POLYMERASE
A-PRIMASE
AUF
EINER
EINZELSTRAENGIGEN,
ACS
HALTIGEN
MATRIZE
.
89
4
5.5.1.
PRAEPARATION
EINER
144
BP
EINZELSTRANG
ARSL-SONDE
MITTELS
ASYM
METRISCHER
PCR
.
89
4.5.5
2.
AUFREINIGUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
DES
DURCH
ASYMMETRISCHE
PCR-AMPLIFIKATION
GEWONNENEN
EINZELSTRAENGIGEN
144
BP
SS
ARS
1
-F
RAGMENTES
.
90
4.5
5
3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHYSIKALISCHEN
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
DEN
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINEN
AUS
S.CEREVISIAE
UND
DER
DNA-POLY
MERASE
A-PRIMASE
AUS
SAEUGERN
.
92
4.5.5.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTIONELLEN
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
DEN
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINEN
AUS
S.CEREVISIAE
UND
DER
DNA-POLY
MERASE
A-PRIMASE
AUS
SAEUGERN
.
94
4.6.
GENETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
DER
AS
AUS
S.CEREVISIAE.
97
4.6.1.
PCR-GESTUETZTE
KONSTRUKTION
VERSCHIEDENER
PUC
19-DERIVATE,
BEI
DENEN
DIE
INTERNE
KODIERENDE
SEQUENZ
DES
AS-GENS
DURCH
EINE
HEFE-MARKERGEN-KASSETTE
ERSETZT
IST
.
98
4.6.2.
TRANSFORMATION
DES
HEFE-INDIKATORSTAMMES
W303-1B
UND
AUSWER
TUNG
DER
WACHSTUMSANALYSEN
.
101
4.6.3.
SOUTHERN-BLOT
ZUM
NACHWEIS
DES
ADE
1
2-KNOCKOUT
.
102
4.7.
MODELLIERUNG
DER
STRUKTUR
DER
HEFE-AS
ANHAND
DER
ROENTGEN
KRISTALLSTRUKTUR-DATEN
FUER
DAS
E.CO/I-HOMOLOG
.
104
4.8.
ORTSSPEZIFISCHES
PHOTOCROSSLINKING
UNTER
EINSATZ
LODDESOXY
URIDIN-SUBSTITUIERTER
OLIGONUKLEOTIDE
.
108
VI
INHALTSVERZEICHNIS
4.8.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
STABILITAET
DER
LODSUBSTITUTION
DER
FUER
DAS
ORTS
SPEZIFISCHE
PHOTOCROSSLINKING
EINGESETZTEN
DNA-OLIGONUKLEOTIDE
.
109
4.8.2.
SPEZIFITAET
DER
PHOTOCROSSLINKING-REAKTION
ZWISCHEN
5-IODDESOXY
URIDIN-SUBSTITUIERTEN
SSARS-T-OLIGONUKLEOTIDEN
UND
DER
AS
.
112
4.8.3.
ORTSSPEZIFISCHES
PHOTOCROSSLINKING
IN
PROTEIN-ROHEXTRAKTEN
.
114
4.8.4.
EFFIZIENZ
DER
PHOTOCROSSLINKING-REAKTION
.
117
5.
DISKUSSION
.
119
5.1.
MODIFIZIERTE
STRATEGIE
ZUR REINIGUNG
DER
BEIDEN
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
ZUR
HOMOGENITAET
.
119
5.2.
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
ADENYLOSUCCINAT-SYNTHETASE
AUS
S.CEREVISIAE
.
120
5.3.
DNA-BINDUNGSVERHALTEN
VON
AS
UND
MRFL-PROTEIN
IM
VERGLEICH
.
122
5.4.
ORTSSPEZIFISCHES
PHOTOCROSSLINKING
ZWISCHEN
SSARS-T-BINDUNGS
PROTEINEN
UND
LODDESOXYURIDIN-SUBSTITUIERTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
125
5.5.
DIE
AS
AUS
S.CEREVISIAE
ALS
BIFUNKTIONELLES
PROTEIN
-
UNTER
SUCHUNGEN
ZUR
WECHSELSEITIGEN
BEEINFLUSSUNG
DER
BEIDEN
PROTEINAKTIVITAETEN
.
127
5.6.
REGULATION
DURCH
PHOSPHORYLIERUNG
.
128
5.7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
STRUKTUR
DER
AS
AUS
SXEREVISIAE
-
KOR
RELATION
ZWISCHEN
STRUKTURELLEN
UND
FUNKTIONELLEN
BEFUNDEN
.
130
5.8.
MOEGLICHE
FUNKTIONEN
DER
SSARS-T-BINDUNGSPROTEINE
IM
ZELLULAEREN
GESCHEHEN
VON
S.CEREVISIAE
.
135
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
141
7.
SUMMARY
.
143
8.
LITERATURVERZEICHNIS
.
145
9.
DANKSAGUNG
.
152 |
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