Einsatz photoreaktiver Nukleotide zur Untersuchung der Wechselwirkung von tRNA mit Elongationsfaktor Tu und Phe-tRNA-Synthetase aus Thermus thermophilus HB8:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
INHALTSVERZEICHNIS
.
III
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
VIII
1
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
SUMMA
RY
.
2
2
EINLEITUNG
.
3
2.1
PHOTOREAKTIVE
NUKLEOTIDE
ZUR
UNTERSUCHUNGVON
RNA-RNA
UND
RNA-PROTEIN
WECHSELWIRKUNG
.
3
2.2
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DER
TRNA
.
5
2.3
DIE
PHERS
AUS
T.
THERMOPHILUS
.
7
2.3.1
DIE
PHERS
GEHOERT
ZUR
KLASSE
II
DER
AA-TRNA-SYNTHETASEN
.
7
2.3.2
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DER
PHERS
.
9
2.4
DER
EF-TU
AUS
T.
THERMOPHILUS
.
11
2.4.1
DER
EF-TU
GEHOERT
ZUR
SUPERFAMILIE
DER
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
.
11
2.4.2
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DES
EF-TU
.
12
2.4.3
DER
KONFONNATIONSUNTERSCHIED
ZWISCHEN
EF-TU-GDP
UND
EF-TU-GTP
.
14
2.5
DIE
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
AMINOACYL-TRNA
UND
EF-TU-GTP
.
16
2.6
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
20
3
MATERIALIEN
.
22
3.1
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE
UND
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDE
.
22
3.2
NAEHRMEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
23
3.3
PROTEINE
UND
ENZYME
.
24
3.4
NUKLEOTIDE
UND
NUKLEINSAEUREN
.
24
3.5
CHEMIKALIEN
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
25
4
METHODEN
.
26
4.1
STANDARDMETHODEN
.
26
4.1.1
ABSORPTIONSMESSUNGEN
.
26
4.1.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
26
4.1.3
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
NUKLEOTIDEN
.
27
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.4
ZENTRIFUGATIONEN
.
27
4.1.5
DETEKTION
UND
BESTIMMUNG
DER
RADIOAKTIVITAET
.
28
4.1.6
KONZENTRIERUNG
UND
LYOPHILISATION
VON
PROTEIN-
UND
RNA-LOESUNGEN
.
29
4.1.7
GELELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
.
30
4.1.7.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
30
4.1.7.2
HAMSTOFF-POLYACRYLAMID-GELEKTROPHORESE
.
30
4.1.7.3
SDS-POLYACRYLAMID
UND
SDS-HAMSTOFF-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
.
30
4.1.8
FAERBUNG
VON
PROTEINEN,
PEPTIDEN
UND
RNA
IM
GEL
.
31
4.1.8.1
"
COOMASSIE
BLAU
"
FAERBUNG
.
31
4.1.8.2
SILBER
FAERBUNG
(BLUM
ETA).,
1987)
.
32
4.1.8.3
"
STAINS
ALL
"
FAERBUNG
(DAHLBERG
ETA/.,
1969)
.
32
4.1.9
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
.
32
4.1.9.1
SPEZIFISCHE
AKTIVITAET
DER
T7
RNAP
.
32
4.1.9.2
SPEZIFISCHE
AKTIVITAET
DER
PHERS
(BURKARD
ETA/.,
1970;
MODIFIZIERT)
.
32
4.1.9.3
AKTIVITAETSTEST
FUER
EF-TU
.
33
4.2
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
33
4.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
UND
GENETISCHE
METHODEN
.
34
4.3.1
REINIGUNG
UND
FAELLUNG
VON
DNA
.
34
4.3.2
REINIGUNG
VON
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDEN
.
34
4.3.3
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
34
4.3.4
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
35
4.3.4.1
VERDAU
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
35
4.3.4.2
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-ENDEN
.
36
4.3.4.3
LIGATION
.
36
4.3.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
36
4.3.6
HYBRIDISIERUNG
VON
OLIGODESOXYRIBONUKLEOTIDEN
.
36
4.3.7
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
.
36
4.3.8
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
37
4.4
ARBEITEN
MIT
NUKLEOTIDEN
UND
RNA
.
37
4.4.1
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
NUKLEOSIDTRIPHOSPHATEN
.
37
4.4.2
PHOTOLYSE
VON
NUKLEOTID
UND
TRNA-ANALOGA
DURCH
UV-BESTRAHLUNG
.
38
4.4.3
OPTISCHE
SCHMELZKURVENPROFILE
VON
TRNAS
.
38
4.4.4
AMINOACYLIERUNG
VON
TRNA
.
39
4.4.5
ENZYMATISCHE
SYNTHESE
VON
TRNA
(MILLIGAN
ETA/.,
1987;
MODIFIZIERT)
.
39
4.4.6
ELUTION
VON
TRNA
AUS
GELEN
.
40
4.4.7
GEWINNUNG
UNFRAKTIONIERTER
NUKLEINSAEUREN
.
40
4.4.8
ISOLIERUNG
UEBERPRODUZIERTER
T.
THEIMOPHILUS
TRNA
PBE
.
41
4.4.8.1
CHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE-CELLULOSE
DE
52
(ZUBAY,
1962;
MODIFIZIERT).
41
4.4.8.2
CHROMATOGRAPHIE
AN
BD-CELLULOSE
(GILLAM
ETA/.,
1967)
.
41
SEITE
IV
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.8.3
CHROMATOGRAPHIE
AN
Q-SEPHAROSE
HP
(MEINNEL
ET
AL.,
1993)
.
41
4.4.8.4
CHROMATOGRAPHIE
AN
SEPHAROSE
6B
.
42
4.4.8.5
CHROMATOGRAPHIE
AN
BIOGEL
P6
.
42
4.4.9
ANALYSE
DER
NUKLEOSID-ZUSAMMENSETZUNG
VON
TRNAS
.
42
4.4.9.1
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
TRNA
(GEHRKE
UND
KUO,
1990)
.
42
4.4.9.2
HPLC-ANALYSE
VON
NUKLEOSIDEN
(GEHRKE
UND
KUO,
1990;
MODIFIZIERT)
.
42
4.5
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
.
43
4.5.1
ZELLAUFSCHLUSS
NACH
LEBERMAN
ET
AL.
(1980)
.
43
4.5.2
ANREICHERUNG
DER
T.THERMOPHILUS
PHERS
.
43
4.5.2.1
CHROMATOGRAPHIE
AN
Q-SEPHAROSE
FF
.
43
4.5.2.2
CHROMATOGRAPHIE
AN
SEPHAROSE
CL-4B
.
44
4.5.2.3
CHROMATOGRAPHIE
AN
FRACTOGEL
EMD
TMAE-650
(S)
.
44
4.5.3
ISOLIERUNG
DER
T7
RNAP
.
44
4.5.4
PRAEPARATION
VON
NUKLEOTID-FREIEM
EF-TU
.
45
4.5.5
WESTERN
BLOT
.
45
4.5.6
ENZYMATISCHE
UND
CHEMISCHE
SPALTUNG
VON
EF-TU
UNTER
LIMITIERTEN
BEDINGUNGEN
.
46
4.5.6.1
REAKTIONSBEDINGUNGEN
FUER
DIE
SPALTUNG
VON
EF-TU
.
46
4.5.6.2
TRENNUNG
DER
PEPTIDE
MITTELS
RP-HPLC
.
47
4.6
ARBEITEN
MIT
PROTEIN-RNA-KOMPLEXEN
.
47
4.6.1
BILDUNG
VON
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXEN
.
47
4.6.2
PROTEIN-TRNA-QUERVEMETZUNG
.
48
4.6.2.1
QUERVEMETZUNG
MIT
2-LMINOTHIOLAN
(TRAUT
ET
AL.,
1973)
.
48
4.6.2.2
QUERVEMETZUNG
DURCH
UV-BESTRAHLUNG
.
48
4.6.3
ANALYTISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXEN
.
49
4.6.3.1
HYDROLYSESCHUTZEXPERIMENTE
(PINGOUD
ET
AL.,
1977)
.
49
4.6.3.2
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
VON
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXEN
.
49
4.6.3.3
SPALTUNG
QUERVEMETZTER
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXE
MIT
RIBONUKLEASE
T1
(ROSEN
ET
AL.,
1993;
MODIFIZIERT)
.
50
5
ERGEBNISSE
.
51
5.1
SYNTHESE
DER
T.
THERMOPHLLUS
TRNA
PLW
UND
IHRER
PHOTOREAKTIVEN
DERIVATE
.
51
5.1.1
SYNTHESE
UND
PHOTOREAKTIVITAET PHOTOSENSITIVER
5'-RIBONUKLEOSIDTRIPHOSPHATE
.
51
5.1.2
KONSTRUKTION
EINES
PLASMIDS
ZUR
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
VON
TRNA"
"
.
56
5.1.3
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
VON
TRNA
.
58
5.1.3.1
REINIGUNG
DER
BAKTERIOPHAGEN
T7
RNAP
.
58
5.1.3.2
ANALYSE
DER
TRANSKRIPTIONSPRODUKTE
.
59
5.1.3.3
OPTIMIERUNG
DER
TRANSKRIPTIONSAUSBEUTE
.
60
5.1.3.4
EINFLUSS
PHOTOREAKTIVER
NUKLEOTID-ANALOGA
AUF
DIE
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
62
5.1.4
SPEKTRALE
ANALYSE
UND
PHOTOLYSE
PHOTOREAKTIVER
TRNA^-TRANSKRIPTE
.
63
SEITE
V
INHALTSVERZEICHNIS
5.2
UEBERPRODUKTION,
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
T.
THERMOPHILUS
TRNA
"
1
*
.
64
5.2.1
UEBERPRODUKTION
DER
T.
THERMOPHILUS
TRNA
"
"
IN
E.
COLI.
.
64
5.2.2
REINIGUNG
DER
UEBERPRODUZIERTEN
TRNA""
.
67
5.2.3
DIE
NUKLEOSIDMODIFIKATIONEN
DER
UEBERPRODUZIERTEN
TRNA
"
"
.
71
5.3
THERMOSTABILITAET
DER
T.
THERMOPHILUS
TRNA"
"
UND
IHRER
PHOTOREAKTIVEN
DERIVATE
.
74
5.4
WECHSELWIRKUNG
DER
T.
THERMOPHILUS
TRNA^'-TRANSKRIPTE
MIT
HOMOLOGEN
PROTEINEN
.
77
5.4.1
AMINOACYLIERUNG
DURCH
PHERS
.
77
5.4.2
WECHSELWIRKUNG
MIT
EF-TU
.
78
5.4.3
NACHWEIS
VON
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXEN
DURCH
GELFILTRATION
.
80
5.5
UV-LICHT-INDUZIERTE
QUERVERNETZUNG
VON
T.
THERMOPHILUS
TRNA^
'
-TRANSKRIPTEN
MIT
HOMOLOGEN
PROTEINEN
.
83
5.5.1
QUERVEMETZUNG
MIT
EF-TU
.
83
5.5.2
QUERVEMETZUNG
MIT
PHERS
.
87
6
DISKUSSION
.
93
6.1
DIE
UEBERPRODUZIERTE
T.
THERMOPHILUS
TRNA
P
"*
WIRD
IN
E.
COLI
AEHNLICH
WIE
ZELLEIGENE
TRNAYY*
MODIFIZIERT
.
93
6.2
DIE
IN
VITRO
SYNTHESE
VON
T.
THERMOPHILUS
TRNA
"
"
UND
IHREN
PHOTOREAKTIVEN
DERIVATEN
.
95
6.2.1
DAS
PHEU-GEN
WIRD
EFFIZIENT
VON
DER
T7
RNAP
TRANSKRIBIERT
.
95
6.2.2
DIE
ENZYMATISCHE
EINFUEHRUNG
PHOTOSENSITIVER
NUKLEOTID-DERIVATE
IN
RNAS
IST
LIMITIERT
.
98
6.3
UNMODIFIZIERTE
TRNA^
'
-MOLEKUELE
SIND
BIOLOGISCH
AKTIV
.
102
6.3.1
NATUERLICHE
MODIFIKATIONEN
DER
TRNA
PHE
SIND
NICHT
AN
DER
ERKENNUNG
DURCH
T.
THERMOPHILUS
PHERS
BETEILIGT
.
102
6
3.2
EF-TU
WECHSELWIRKT
MIT
UNMODIFIZIERTEM
TRNA^-TRANSKRIPT
.
103
6.3.3
DAS
TRNA-TRANSKRIPT
BESITZT
EINE
FLEXIBLERE
TERTIAERSTRUKTUR
.
104
6.4
DER
EINFLUSS
NICHT-NATUERLICHER
MODIFIKATIONEN
AUF
DIE
WECHSELWIRKUNG
IN
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXEN
.
107
6.4.1
DIE
PHERS
UND
PHOTOREAKTIVE
TRNA^-ANALOGA
.
107
6.4.2
DER
EF-TU
UND
PHOTOREAKTIVE
PHE-TRNA
PHE
-ANALOGA
.
109
6.4.3
LYSIN-SPEZIFISCHE
MODIFIZIERUNGEN
DES
EF-TU
VERHINDERN
DIE
BILDUNG
DES
TERNAEREN
KOMPLEXES
.
111
SEITE
VI
INHALTSVERZEICHNIS
6.5
"
NULL-DISTANZ
"
-QUERVEMETZUNGEN
ZWISCHEN
BASEN
UND
AMINOSAEURE-SELTENKETTEN
SIND
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
WECHSELWIRKUNGEN
IM
[EF-TU-GTP-AA-TRNA]
KOMPLEX
NICHT
GEEIGNET
.
113
6.5.1
PHOTOREAKTIVE
URACIL-ANALOGA
LIEGEN
IM
TERNAEREN
KOMPLEX
ZU
WEIT
VON
GEEIGNETEN
AMINOSAEURE-SEITENKETTEN
ENTFERNT
.
114
6.5.2
UNMODIFIZIERTE
UND
MIT
URIDIN-ANALOGA-SUBSTITUIERTE
TRNA^'-TRANSKRIPTE
SIND
IN
PROTEIN-TRNA-KOMPLEXEN
PHOTOREAKTIV
.
117
6.5.3
DIE
FUER
ELEKTRONISCHE
UEBERGAENGE
ERFORDERLICHE
BEWEGUNGSFREIHEIT
DER
PYRIMIDIN-BASEN
WIRD
DURCH
INTERAKTIONEN
MIT
EF-TU
EINGESCHRAENKT
.
118
6.6
QUERVEMETZUNG
VON
S
4
U-SUBSTITULERTER
TRNA
PH
*
MIT
PHERS
.
120
6.7
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
.
123
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
125
8
ANHANG
.
142
8.1
ANREICHERUNG
DER
T.
THEMOPHILUS
PHERS
.
142
8.2
REINIGUNG
DER
UEBERPRODUZIERTEN
T.
THEMOPHILUS
TRNAZ
"
"
.
144
8.3
BESTIMMUNG
DER
SCHMELZTEMPERATUR
T
M
VON
TRNAS
.
145
8.4
QUANTITATIVE
AUSWERTUNG
DER
NUKLEOSID-ANALYSE
VON
TRNAS
.
146
8.5
BERECHNUNGEN
ZU
DEN
QUERVEMETZUNGSEXPERIMENTAN
.
146
8.5.1
BERECHNUNG
DER
BESTRAHLUNGSDOSIS
.
146
8.5.2
BERECHNUNG
DER
QUANTENAUSBEUTE
.
149
DANKSAGUNG
.
150
ERKLAERUNG
.
152
SEITE
VII |
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| author | Hoffmüller, Petra |
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