Expression des regulatorischen nef-Gens in SIVagm3-infizierten Zellkulturen: Charakterisierung nef-kodierenden mRNAs
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
10
2
LITERATURIIBERSICHT
.
12
2.1
DIE
RETROVIREN
.
12
2.2
DIE
PRIMATEN-IMMUNDEFIZIENZVIREN
.
13
2.2.1
VIRUSSTRUKTUR
(AM
BEISPIEL
VON
HIV-1)
.
13
2.2.2
DER
REPLIKATIONSZYKLUS
DER
IMMUNDEFIZIENZVIREN
.
14
2.2.3
DIE
REGULATORISCHEN
ODER
AKZESSORISCHEN
PROTEINE
DER
IMMUNDEFIZIENZVIREN
.
15
2.2.3.1
DIE
FUNKTION
DER
REGULATORISCHEN
PROTEINE
.
15
2.2.3.2
EXPRESSION
DER
REGULATORISCHEN
GENE:
KOMPLEXES
SPLEISSEN
DER
TRANSKRIPTE
DER
REGULATORISCHEN
GENE
.
19
2.2.4
VERLAUF
UND
PATHOGENESE
DER
PRIMATEN-IMMUNDEFIZIENZVIRUS-INFEKTION
.
20
2
2.5
HIV
UND
SIV
.
22
2.2.6
FAKTOREN,
DIE
FUER
DIE
APATHOGENITAET
VON
SIVAGM
VERANTWORTLICH
SEIN
KOENNTEN
.
23
2.2
6.1
WIRTSFAKTOREN
.
23
2
2.6
2
VIRALE
FAKTOREN
.
25
3
PROBLEMSTELLUNG
.
28
4
MATERIAL
UND
METHODEN
.
29
4
1
VERWENDETES
VIRUSISOLAT,
VIRUSPRAEPARATION
UND
-VERMEHRUNG
.
29
4.2
ZELLKULTUR
VON
HUMANEN
T-ZELLINIEN
.
30
4.3
ISOLIERUNG
UND
ZELLKULTUR
VON
PRIMAEREN
LYMPHOZYTEN
UND
MONOZYTEN
AUS
DEM
BLUT
AFRIKANISCHER
GRUNER
MEERKATZEN
.
30
4.4
ANREICHERUNG
CD4-REZEPTORTRAGENDER
(CD4+)
AGM-PBMC
.
31
4.4
1
DEPLETION
DER
CD8-REZEPTORTRAGENDEN
(CD8+)
T-ZELLEN
.
31
4.4
2
SUPERANTIGEN-STIMULATION
VON
AGM-PBMC
.
31
4.4.3
ERMITTLUNG
DES
VERHAELTNISSES
DER
CD4
UND
CD8-REZEPTORTRAGENDEN
ZELLEN
BEI
AGM-PBMC
.
31
4.5
BESTIMMUNG
DES
INFEKTIONSTITERS
VON
SIVAGM3
IN
DER
ZELLKULTUR
(VIRUSTITRATION)
.
32
4.6
INFEKTION
VON
AGM-PBMC
UND
MOLT
4/8
ZELLEN
MIT
SIVAGM3
.
32
4.7
ISOLIERUNG
VON
RNRNA
AUS
INFIZIERTEN
MOLT
4/8-ZELLEN
UND
AGM-PBMC
.
32
4
8
NACHWEIS
VON
VIRALEM
ANTIGEN
IN
SIVAGM3-INFIZIERTEN
ZELLEN
MIT
DER
ALKALISCHE
PHOSPHATASE-ANTI-ALKALISCHE
PHOSPHATASE-TECHNIK
(APAAP)
.
33
4.9
EXTRAKTION
ZYTOPLASMATISCHER
RNA
.
34
4.10
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
.
34
4.10.1
DENATURIERENDE
RNA-GELELEKTROPHORESE
.
34
4.102
TRANSFER
UND
IMMOBILISIERUNG
DER
RNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
.
35
4.10.3
HYBRIDISIERUNG
.
35
4.11
ZP-OIIGONUIDEOTID-MARKIERUNG
.
35
4.12
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)
.
36
4
12.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
.
36
_
INHALTSVERZEICHNIS
6
4.12.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
36
4.13
PCR-PRODUKTANALYSE
.
37
4.13.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
37
4.13.2
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
38
4.13.2.1
ALKALISCHER
TRANSFER
.
38
4.13.2.2
HYBRIDISIERUNG
DER
IMMOBILISIERTEN
PCR-PRODUKTE
MIT
EXONSPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTIDSONDEN
.
38
4.13.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
38
4.14
REINIGUNG
UND
KONZENTRATION
VON
PCR-PRODUKT
.
39
4.15
KLONIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
.
39
4.16
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
TRANSFORMIERTEN
EXOLI
XL1
.
40
4.17
ANALYSE
DER
CDNA-KLONE
.
41
4.17.1
RESTRIKTIONSENZYMANALYSE
DER
PLASMID-DNA
.
41
4.17.2
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
41
4.17.3
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
.
41
4.17.3.1
TRANSFER
DER
KOLONIEN
AUF
NITROCELLULOSE-FILTER,
LYSIS
DER
KOLONIEN
UND
BINDUNG
DER
DNA
AN
DIE
FILTER
.
41
4.17.3.2
HYBRIDISIERUNG
MIT
EXONSPEZIFISCHEN,
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
OLIGONUKLEOTID
SONDEN
(VGL.
4.13.2.2)
.
42
4.17.4
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA-KLONE
.
42
4.17.4.1
HERSTELLUNG
VON
EINZELSTRANG-DNA
.
42
4.17.4.2
SEQUENZIERUNGSREAKTION
.
43
4.17.4.3
SEQUENZGEL
.
44
4.17.4.4
COMPUTERGESTUETZTE
SEQUENZANALYSE
.
44
5
ERGEBNISSE
.
45
5.1
SIVAGM3-INFEKTION
DER
HUMANEN
T-LYMPHOIDEN
ZELLINIE
MOLT
4/8
UND
PERIPHERER
MONONUKLEAERER
BLUTZELLEN
(PBMC)
VON
AFRIKANISCHEN
GRUENEN
MEERKATZEN
.
45
5.1.1
DEPLETION
DER
CD8-REZEPTORTRAGENDEN
T-ZELLEN
VON
AGM-PBMC
.
45
5.1.2
SUPERANTIGEN-STIMULIERUNG
.
48
5.1.3
INFEKTIONSKINETIK
DER
SIVAGM3-INFEKTION
VON
MOLT
4/8
ZELLEN
UND
AGM-PBMC
.
50
5.1.3.1
NACHWEIS
VON
INFEKTIOESEM
VIRUS
IM
ZELLKULTURUEBERSTAND
IM
VERLAUF
DER
INFEKTION.
50
5.1.3.2
NACHWEISBARKEIT
VON
VIRALEM
ANTIGEN
IN
DEN
INFIZIERTEN
ZELLEN
IM
INFEKTIONSVERLAUF.
51
5.1.3.3
NACHWEIS
VIRALER
RNAS
IM
VERLAUF
DER
INFEKTION
.
53
5.2
ANALYSE
DER
TRANSKRIPTE
DER
REGULATORISCHEN
GENE
(NE/-KODIERENDE
TRANSKRIPTE
VON
SIVAGM3
.
54
5.2.1
OPTIMIERUNG
DER
RT-PCR
.
57
5.2.2
ANALYSE
DER
PRODUKTE
DER
RT-PCR
MIT
MRNA
AUS
MOLT
4/8
ZELLEN
UND
AGM-PBMC
IM
VERLAUF
DER
SIVAGM3-INFEKTION
.
58
5.2.3
EFFEKT
DER
SUPERANTIGEN-STIMULIERUNG
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
REGULATORISCHEN
GENE
IN
SIVAGM3-INFIZIERTEN
AGM-PBMC
.
63
5.2.4
CHARAKTERISIERUNG
DER
RT-PCR-PRODUKTE
DURCH
HYBRIDISIERUNG
MIT
EXONSPEZIFISCHEN
SONDEN
.
65
5.2.5
ANALYSE
VON
KLONIERTEN
RT-PCR-PRODUKTEN
.
68
5.2.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
CDNA-KLONE
DURCH
HYBRIDISIERUNG
MIT
EXONSPEZIFISCHEN
SONDEN
.
70
5.2.7
BESTIMMUNG
DER
EXONGRENZEN
DURCH
SEQUENZIERUNG
DER
CDNA-KLONE
.
72
_
INHALTSVERZEICHNIS
7
5.3
STRUKTUR
DER
TRANSKRIPTE
DER
REGULATORISCHEN
GENE
VON
SIVAGM3
.
75
5.3.1
IDENTIFIZIERTE
EXONS
.
75
5.3.2
VERGLEICH
DER
SPLEISSSTELLEN
IM
SIVAGM3-GENOM
MIT
DEN
ERKENNUNGSSEQUENZEN
FUER
DAS
SPLEISSEN
EUKARYOTER
MRNAS
.
78
5.3.3
EXONZUSAMMENSETZUNG
DER
IDENTIFIZIERTEN
TRANSKRIPTTYPEN
.
79
5.3.4
RELATIVE
HAEUFIGKEIT
DER
MEHRFACH
GESPLEISSTEN
TRANSKRIPTE
BEI
SIVAGM3
.
82
5
3.5
EXPRESSION
DER
REGULATORISCHEN
GENE
IM
VERLAUF
DER
INFEKTION
VON
AGM-PBMC
.
84
5.4
VERGLEICH
MIT
DEN
TRANSKRIPTEN
DER
REGULATORISCHEN
GENE
ANDERER
PRIMATEN-IMMUNDEFIZIENZVIREN
.
86
5.4.1
DIE
STRUKTUR
DER
TRANSKRIPTE
.
86
5.4
2
DIE
RELATIVE
HAEUFIGKEIT
DER
UNTERSCHIEDLICHEN
TRANSKRIPTE
.
90
6
DISKUSSION
.
93
7
ZUSAMMENFASSUNG
.
101
8
LITERATURVERZEICHNIS
.
103
9
DANKSAGUNG
.
117
10
LEBENSLAUF
.
118 |
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