Untersuchungen zu den Eigenschaften von nativem und enzymatisch deglycosyliertem Kollagen Typ 1: besteht ein funktioneller Zusammenhang zwischen den Änderungen im Kollagenmetabolismus und der erhöhten Aktivität der lysomalen b-Galactosidase in der Sklerodermie?
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS SEITE
1. EINLEITUNG 1
1.1 EINFLUSS DER PROTEINE DER EXTRAZELLULAEREN MATRIX AUF DIE
BINDEGEWEBSZELLE 2
1.2 STRUKTUR UND FUNKTION DER KOLLAGENE 3
1.2.1 BIOSYNTHESE UND ABBAU VPN KOL LAGEN TYP I 4
1.2.2 GLYCOSYLIERUNG DES KOLLAGENS 8
1.2.3 REGULATION DES KOLLAGENSTOFFWECHSELS 10
1.3 INTEGRINE 11
1.4 SKLERODERMIE 12
1.5 LYSOSOMALE SS-GALACTOSIDASE 14
2. AUFGABENSTELLUNG ~ 16
3. MATERIAL UND METHODEN 17
3.1 MATERIAL 17
3.1.1 CHEMIKALIEN 17
3.1.2 ENZYME UND ANTIKOERPER 18
3.1.3 MEDIEN, LOESUNGEN, PUFFER 18
3.2 METHODEN 21
3.2.1 ALLGEMEINE METHODEN 21
3.3.1.1 ELEKTROPHORESE 21
3.3.1.2 WESTERN-BLOT 21
3.2.1.3 PROTEINBESTIMMUNG 22
3.2.2 KOLLAGENPRAEPARATION 22
3.2.2.1 HUMANES KOLLAGEN TYP I AUS HAUT 22
3.2.2.2 KOLLAGEN AUS RATTENSCHWANZSEHNE 22
3.2.3 ENZYMATISCHE DEGLYCOSYLIERUNG VON KOLLAGEN 23
3.2.4 NACHWEIS DER DEGLYCOSYLIERUNG 23
3.2.4.1 ANTI-DIG NACHWEIS 23
3.2.4.2 AMINOSAEUREANALYSE 24
3.2.5 VERGLEICH DER PHYSIKOCHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN VON NATIVEM UND
MIT GLYCOSIDASEN BEHANDELTEM KOLLAGEN 24
3.2.5.1 CD-SPEKTROSKOPIE 24
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.2.5.2 TNS-FLUORESZENZ 25
3.2.5.3 FIBRILLENBILDUNG 25
3.2.5.4 MESSUNG DES FIBRILLENDURCHMESSERS IM ELEKTRONENMIKROSKOP 26
3.2.5.5 ABBAU DURCH PROTEASEN 26
3.2.6 ZELL-MATRIX-INTERAKTIONEN 27
3.2.6.1 ZELLKULTUR 27
3.2.6.1.1 GEWINNUNG VON FIBROBLASTEN AUS EXPLANTATEN 27
3.2.6.1.2 SUBKULTIVIERUNG 27
3.2.6.1.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 27
3.2.6.2 CHEMOTAXIS/MIGRATION 27
3.2.6.3 GELKONTRAKTION 28
3.2.7 GELFILTRATION VON KULTURUEBERSTAENDEN 28
3.2.8 ENZYMHISTOCHEMIE UND IMMUNCYTOCHEMIE 28
3.2.9 AKTIVITAETSMESSUNGEN LYSOSOMALER ENZYME 29
3.2.10 STATISTISCHE AUSWERTUNG DER DATEN 30
4. ERGEBNISSE 31
4.1 KOLLAGENPRAEPARATION 31
4.2 DEGLYCOSYLIERUNG
32
4.2.1 NACHWEIS DURCH ANTI-DIG SYSTEM 32
4.2.3 NACHWEIS DURCH AMINOSAEUREANALYSE 33
4.3 VERGLEICH DER PHYSIKOCHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN VON NATIVEM UND MIT
GLYCOSIDASCN BEHANDELTEN KOLLAGEN
35
4.3.1 SCHMELZTEMPERATUR 35
4.3.2 TNS-FLUORESZENZ 37
4.3.2.1 EMISSIONSSPEKTREN 37
4.3.2.2 TITRATIONSKURVEN 37
4.3.3 FIBRILLAERES KOLLAGEN 40
4.3.3.1 FIBRILLENBILDUNG 40
4.3.3.2 DURCHMESSER 42
4.3.4 ABBAU DURCH PROTEASEN 46
4.4. ZELL-MATRIX-INTERAKTION
47
4.4
.1 CHEMOTAXIS/MIGRATION 47
4.4.2 GELKONTRAKTION 50
4.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR SS-GALAKTOSIDASE 52
4.5.1 GELFILTRATION 52
4.5.2 ENZYMHISTOCHEMIE UND IMMUNCYTOCHEMIE 55
4.6 UNTERSUCHUNGEN AM TIERMODELL FUER SKLERODERMIE 60
4.6.1 PH-OPTIMA DER GEMESSENEN ENZYME 60
4.6.2 ENZYMAKTIVITAETEN IN SERUM UND GEWEBE 62
5. DISKUSSION 65
5.1 EINFLUSS DER ENZYMATISCHEN DEGLYCOSYLIERUNG AUF DIE VERSCHIEDENEN
ORGANISATIONSEBENEN DES KOLLAGENS 65
5.1.1 SEKUNDAERSTRUKTUR 65
5.1.2 TERTIAERSTRUKTUR 67
5.1.3 MAKROMOLEKULARE ORGANISATION 69
5.2 EINFLUSS DER ENZYMATISCHEN DEGLYCOSYFIERUNG AUF
ZELL-MATRIX-INTERAKTIONEN 74
5.3 ABBAU DURCH KOLLAGENUNSPEZIFISCHE PROTEASEN 77
5.4 SS-GALACTOSIDASE 78
5.4.1 BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DER LYSOSOMALEN SS-GALACTOSIDASE 78
5.4.2 AKTIVITAETEN IN PATHOLOGISCHEN ZUSTAENDEN 78
5.4.3 SEKRETION DER LYSOSOMALEN SS-GALACTOSIDASE AUS FIBROBLASTEN 79
5.4.4 SS-GALACTOSIDASE-AKTIVITAETEN IN GEWEBESCHNITTEN 82
5.5 KOLLAGCN, IN VIVO EIN POTENTIELLES SUBSTRAT DER GALACTOSIDASC? 83
6. ZUSAMMENFASSUNG 86
7. LITERATURVERZEICHNIS
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