Herstellung und Testung von zwei bispezifischen Antikörpern (anti-HN x anti-CD28 und anti-HN x anti-CD3) zur Koppelung an eine NDV-modifizierte autologe Tumorzellvakzine:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN.1
A ZIELSETZUNG DER ARBEIT.3
B EINLEITUNG.4
1 ALLGEMEINE EINFUEHRUNG.4
2 DER T-ZELL-REZEPTOR.5
3 COSTIMULATION.5
4 IMMUNTHERAPIE VON TUMOREN.8
4.1 MONOKLONALE ANTIKOERPER UND IHRE VERWENDUNG IN DER TUMORTHERAPIE.10
4.2 BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER.11
4.3 ADOPTIVE IMMUNTHERAPIE.13
4.4 AKTIV-SPEZIFISCHE IMMUNTHERAPIE VON TUMOREN. 13
C MATERIAL UND METHODEN.16
1 MATERIAL.16
1.1 CHEMIKALIEN.16
1.2 ANTIKOERPER.18
1.3 LOESUNGEN/PUFFER.19
1.3.1 PBS (PHOSPHATGEPUFFERTE SALZLOESUNG).19
1.3.2 PUFFER FUER DIE IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.19
1.3.3 PUFFER FUER DIE ANTIKOERPERREINIGUNG UEBER PROTEIN G-SAEULE.19
1.3.4 PUFFER FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS-PUFFER).19
1.3.5 ERYTHROZYTENLYSEPUFFER.20
1.3.6 TRYPANBLAUFAERBELOESUNG.20
1.4 MEDIEN UND ZUSAETZE FUER DIE ZELLKULTUR.20
1.4.1 KULTURMEDIUM.20
1.4.3 EINFRIERMEDIUM.20
1.4.4 HAT-UND HT-SELEKTIONSMEDIUM.21
1.5 MATERIAL FUER DIE ZELLKULTUR.21
2 METHODEN.22
2.1 ALLGEMEINE ZELLBIOLOGISCHE METHODEN.22
2.1.1 TUMORZELLINIEN.22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
2.1.2 KULTIVIERUNG DER ZELLEN.22
2.1.3 KULTIVIERUNG DER PRIMAEREN ZELLINIEN. 23
2.1.4 KULTIVIERUNG DER ETABLIERTEN ZELLINIEN.23
2.1.5 INAKTIVIERUNG DER TUMORZELLEN.23
2.1.6 ZAEHLEN DER ZELLEN.23
2.1.7 ISOLIERUNG PERIPHERER MONONUKLEAERER BLUTZELLEN (PBMCS).23
2.1.8 DEPLETION VON MONOZYTEN UEBER ADHAERENZ.24
2.1.9 T-ZELL-ISOLIERUNG.24
2.1.10 IN VITRO STIMULIERUNG VON ANGEREICHERTEN T-ZELLEN MIT RHIL-2.
24
2.1.11 STIMULIERUNG VON PBLS MIT PHA.25
2.1.12 STIMULIERUNG AUFGEREINIGTER T-ZELLEN MIT BSAK.25
2.1.13 BELADUNG VON TUMORZELLEN MIT BSAK.25
2.1.14 ZYTOTOXIZITAETSTEST.25
2.1.15 PROLIFERATIONSTEST.26
2.1.16 TUMORWACHSTUMSINHIBITIONSTEST. 26
2.1.17 STIMULIERUNG AUTOLOGER PBMCS MIT BSAK.27
2.1.18 EXPERIMENTE MIT VOLLBLUTKULTUREN.27
2.2 METHODEN ZUR HERSTELLUNG BISPEZIFISCHER ANTIKOERPER.27
2.2.1 ERZEUGUNG VON HAT-SENSITIVITAET.27
2.2.2 KLONIERUNG VON HYBRIDOMZELLEN.27
2.2.3 HERSTELLUNG DER BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER.28
2.2.4 PRODUKTION VON ANTIKOERPERN IN VITRO.28
2.3 HERSTELLUNG VON MURINEN MILZZELLSUSPENSIONEN FUER DIE
SUBKLONIERUNG.29
2.4 ZELLADHAESIONSEXPERIMENTE. 29
2.5 DURCHFLUSSZYTOMETRIE. 29
2.6 PROTEINCHEMISCHE METHODEN.30
2.6.1 AUFREINIGUNG VON MAK UEBER EINE PROTEIN G-SAEULE.30
2.6.2 IONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE.30
2.6.3 PROTEINBESTIMMUNG. 30
2.6.4 SDS-POLYACIYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).30
2.6.5 FAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN MIT COOMASSIE BLAU.31
3 NEWCASTLE DISEASE VIRUS NDV.31
3.1 VIRUSANZUECHTUNG IN HUEHNEREIERN.32
3.2 HAEMAGGLUTINATIONSTEST. 32
INHALTSVERZEICHNIS 111
3.3 MODIFIZIERUNG VON TUMORZELLEN MIT NDV.33
D ERGEBNISSE.34
1 EIGENSCHAFTEN DER MONOKLONALEN, MONOSPEZIFISCHEN ANTIKOERPER.34
1.1 DER MONOKLONALE HN.B ANTIKOERPER.34
1.2 DER MONOKLONALE ANTI-CD3 ANTIKOERPER (OKT3).36
1.3 DER MONOKLONALE ANTI-CD28 ANTIKOERPER (CD28.E).37
2 UNTERSUCHUNGEN ZUR NDV-MODIFIKATION VON TUMORZELLEN.40
2.1 JEDE TUMORZELLE BZW. TUMORZELLINIE KANN MIT NDV MODIFIZIERT
WERDEN.40
2.2 DIE NDV-MODIFIKATION ERFOLGT INNERHALB KUERZESTER ZEIT.40
3 HERSTELLUNG DER BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER.42
4 AUFREINIGUNG DER BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER UEBER HPLC.43
4.1 HPLC-AUFREINIGUNG DES BSAK HNXCD28.45
4.2 HPLC-AUFREINIGUNG DES BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPERS BSAK HNXCD3.46
5 CHARAKTERISIERUNG DER AUFGEREINIGTEN BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER.48
6 NACHWEIS DER BISPEZIFITAET MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE.50
6.1 BISPEZIFITAET DES HYBRID-ANTIKOERPERS BSAK HNXCD28.50
6.2 BISPEZIFITAET DES HYBRID-ANTIKOERPERS BSAK HNXCD3.53
7 NACHWEIS DER BISPEZIFITAET UEBER ANTIKOERPER VERMITTELTE ZIELZELLYSE.54
8 SPEZIFITAET DER HYBRID-ANTIKOERPER FUER NDV.56
9 NDV-EFFEKT.57
9.1 NDV-EFFEKT IM ZYTOTOXIZITAETSTEST.57
9.2 BLOCKADE DES NDV-EFFEKTES DURCH DEN MAK HN.B.58
10 KOMBINATION BEIDER BISPEZIFISCHER ANTIKOERPER IM ZYTOTOXIZITAETSTEST.59
11 TITRATION DER BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER.60
11.1 TITRATION DES BSAK HNXCD28.60
11.2 TITRATION DES BSAK HNXCD3.61
INHALTSVERZEICHNIS
IV
12 KINETIK DER BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER VERMITTELTEN ZYTOTOXIZITAET.62
13 DURCH BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER INDUZIERTE PROLIFERATION.62
14 EINFLUSS DER BSAK AUF DIE EXPRESSION VON AKTIVIERUNGSMARKEM.64
15 TITRATION DER BSAK UND IHR EINFLUSS AUF DIE EXPRESSION DER
AKTIVIERUNGSMARKER.67
15.1 EFFEKT DER BSAK KONZENTRATION AUF DIE EXPRESSION DES
CD25-MOLEKUELS. 67
15.2 EFFEKT DER BSAK KONZENTRATION AUF DIE EXPRESSION DES
CD69-MOLEKUELS. 68
16 VERWENDUNG DER BSAK IN DER INDUKTIONS- UND EFFEKTORPHASE EINER
IMMUNANTWORT. 69
16.1 AKTIVIERUNG HUMANER T-ZELLEN DURCH DIE BSAK UND NACHFOLGENDEM
KILL. 69
16.2 ZUSAETZLICHE VERWENDUNG DER BSAK IM KILL-ANSATZ.71
17 TUMORWACHSTUMSINHIBITIONSTEST. 71
18 AUTOLOGES TUMORSYSTEM.74
19 AUTOLOGES TUMORSYSTEM - KOLONKARZINOM.75
19.1 NDV-MODIFIKATION DER TUMORZELLEN.75
19.2 EXPRESSION VON AKTIVIERUNGSMARKEM NACH STIMULATION MIT DEN BSAK.76
20 AUTOLOGES TUMORSYSTEM - GLIOBLASTOM.79
20.1 EXPRESSION VON AKTIVIERUNGSMARKEM NACH STIMULATION MIT DEN BSAK.79
21 AUTOLOGES TUMORSYSTEM - PLATTENEPITHELKARZINOM DES LARYNX
(KEHLKOPFES).82
21.1 NDV-MODIFIKATION DER TUMORZELLEN.82
21.2 EXPRESSION VON AKTIVIERUNGSMARKEM NACH STIMULATION MIT BSAK.83
21.3 PROLIFERATION DER PERIPHEREN BLUTLYMPHOZYTEN IN KULTUR.86
21.4 PROLIFERATIONSTEST MIT VOLLBLUT.87
21.5 TUMORWACHSTUMSINHIBITIONSTEST MIT VOLLBLUT.88
E DISKUSSION.90
1 BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER UND TUMORTHERAPIE.90
2 COSTIMULATION.91
3 EINFUEHRUNG COSTIMULATORISCHER MOLEKUELE UEBER BISPEZIFISCHE
ANTIKOERPER.94
INHALTSVERZEICHNIS
V
4 BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER UND DIE AKUEVIERUNGSMAIKER CD25 UND CD69.96
5 BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER UND TUMORWACHSTUMSINHIBITION.99
6 BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER UND AKTIV-SPEZIFISCHE IMMUNTHERAPIE.100
F ZUSAMMENFASSUNG.104
G LITERATUR. 105
H ANHANG - DANKSAGUNG. 112 |
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