Untersuchungen zur Bedeutung der Phosphatkontakte für Spezifität und katalytische Aktivität der Restriktionsendonuklease EcoRI:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
_
.
_
.
_
YY
_
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
_
_
.
_
15
2.1
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
.
.
15
2.1.1
BAKTERIENSTIMME
.
15
2.1.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
COLI
ZELLEN
UND
TRANSFORMATION
_
.
15
2.1.3
VEKTOREN
.
17
2.2
PROTEINCHEMISCHE
ARBEITEN
.
18
2.2.1
PROTEIN-AUFREINIGUNG
.
_
.
18
2.2.2
SEMI
DRY
WESTERN
BLOT
.
_
.
18
2.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
.
19
2.3.1
GEZIELTE
MUTAGENESE.
.
19
2.3.1.1
GAPPED
DUPLEX-MUTAGENESE.
19
23.1.2
PCR-MUTAGENESE
------
.
_
20
2.3.1.3
MUTAGENESEPRIMER
.
24
2.4
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTIERTEN
ENZYME.
26
2.4.1
BESTIMMUNG
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITLT
_
.
_
.
_
.
26
2.4.2
PUC8-KINETIKEN
_
26
2.43
RADIOAKTIVE
OLIGNUKLEOTIDKINETIKEN.
_
.
27
2.43.1
VORBEREITUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE
.
27
2.43.2
OLIGONUKLEOTIDSEQUENZEN
.
_
_
_
.
27
2.43.3
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
OLIGONUKLEOTIDE.
29
2.43.4
SPALTANSITZE
.29
2.43.5
HOMOCHROMATOGRAPHIE.
29
2.4.4
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
(MO6TF/0SSA0MNQYS).YY.
_
.
30
2.4.4.1
HERSTELLUNG
DES
SA^-SUBSTRATES.
31
2.4.4.2
BINDUNGSANSITZE.
32
2.4.43
NATIVE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.
_
32
2.4.4.4
C^'-MOBILITY-SHIFT-ASSAY
_
33
2.4.5
PFOM/FTY-TEST
_
34
2.4.6
CIRCULARDICHROISMUS
.
_
.
_
.
35
2.4.6.1
CD-SPEKTREN
_
35
2.4.7
BESTIMMUNG
DER
FLANKENSEQUENZPRLFERENZ
.
35
2.4.7.1
SEITENSEQUENZ-ANREICHERUNG
_
.
36
3
ERGEBNISSE
.
3*
1
MUTAGENESE
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY
3.2
VIABILITY-DATEN
_
3.3
PROTEIN-AUFARBEITUNGEN.
-
.
3.4
CD-SPEKTREN
3.5
SPALTVERHALTEN
.
_
.
3.5.1
STANDARD
UND
STARSPALTUNGEN.
3.5.2
MG^-OPTIMIERUNG
.
3.53
MG
,
7CA
H
-KOMPETITIONSSPALTUNG
3.6
BINDUNGSDATEN
YY.
_
.
38
38
40
42
45
46
46
49
51
53
3.7
K
M
-BESTIMMUNG
FUER
DIE
K130E
MUTANTE.
-
.
.
55
3.8
BESTIMMUNG
DER
SEITENSEQUENZSPEZIFLTUET
FUER
DIE
K130E
MUTANTE
.56
3.8.1
POOLSEQUENZIENINGEN.
_
.
-
.
58
3.8.2
EINZELKLONSEQUENZIERUNGEN.
62
3.83
CONSENSUSSEQUENZEN
.68
3.8.4
KOMPLEMENTAERE
FLANKENSEQUENZERWEITERUNG.
_
69
3.8.5
RADIOAKTIVE
OLIGONUKLETIDKINETIKEN.
70
3.8.6
VERGLEICH
DER
SPALTGESCHWINDIGKEITEN
VON
EINZELKLONEN
DER
.
SEITENSEQUENZANREICHERUNGEN.
73
3.8.7
DNA-STRUKTUREIGENSCHAFTEN
DER
ANREICHERUNGSSEQUENZEN
.
76
3.8.7.1
DINUKLEOTIDBESCHREIBUNGEN
GEMIO
DELCOURT
&
BLAKE.
76
3.S.7.2
BESCHREIBUNG
DER
TRINUKLEOTIDEIGENSCHAFTEN
NACH
TRAVERS
.
78
3.8.73
AUSWERTUNG
DER
DNA-HELIX-EIGENSCHAFTEN
FUER
BASENPAARE.
82
4
DISKUSSION
.86
5
ZUSAMMENFASSUNG
_
108
6
LITERATURVERZEICHNIS
110
7
ANHANG
-
------------------------------------------------
----------------------------------
121
7.1
ECORI-AMINOSUEURE
UND
BASENSEQUENZ.
.
121
7.2
EINZELKLONSEQUENZEN
DER
ANREICHERUNG
.
122
7.3
PRIMER
.
124
7.3.1
ECORI
PRIMER
_
124
73.2
SAJ/HUBSTRATPRIMER.
.
-
.
124
7.33
PUC8-SEQUENZIERPRIMER.
.
124 |
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