Die Dimethylglycindehydrogenase: Isolierung und Charakterisierung eines cDNA-Klones ; Untersuchungen zur zellspezifischen Expression in der Rattenleber und -niere
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1995
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-
1
-
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
LISTE DER ABKUERZUNGEN V
1. EINLEITUNG 2
1.1. CHOLIN UND SEINE BEDEUTUNG FUER DEN ORGANISMUS 2
1.2. DER CHOLINABBAU 3
1.3. FAD ALS KOFAKTOR 4
1.4. TETRAHYDROFOLSAEURE ALS KOFAKTOR 10
1.5. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER DIMETHYL-
GLYCINDEHYDROGENASE 11
1.6. FRAGESTELLUNG UND ZIEL DER ARBEIT 13
2. MATERIALIEN UND METHODEN 15
2.1. MATERIALIEN 15
2.1.1. BAKTERIENSTAEMME 15
2.1.2. PRIMAERE ZELLKULTUREN AUS DER LEBER 15
2.1.3. GENBANK 16
2.1.4. VEKTOREN 16
2.1.5. OLIGONUKLEOTIDE 12
2.1.5.1. OLIGONUKLEOTIDE ZUM DURCHMUSTEM DER GENBANK 17
2.1.5.2. SEQUENZIERPRIMER 18
2.1.5.3. PRIMER FUER DIE PCR 19
2.2. METHODEN 20
2.2.1. KOLONIEHYBRIDISIERUNG 20
2.2.2. ISOLIERUNG VON DNA 22
2.2.2.1. DNA-ISOLIERUNG IM CSCL-GRADIENTEN 22
2.2.2.2. MIDI-PRAEPARATION VON DNA 22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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- II -
SEITE
2.2.2.3. MINI-PRAEPARATION VON DNA 23
2.2.3. ISOLIERUNG VON RNA 23
2.2.4. GRUNDLEGENDE METHODEN DER REKOMBINATION VON DNA 25
2.2.4.1. SPALTEN VON DNA 25
2.2.4.2. DEPROTEINIERUNG VON DNA-LOESUNGEN 26
2.2.4.3. FAELLEN VON DNA 26
2.2.4.4. ANFAERBEN VON DNA DURCH ETHIDIUMBROMID 27
2.2.4.5. ELEKTROELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 27
2.2.4.6. LIGIEREN 27
2.2.5. ELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 28
2.2.5.1. AGAROSEGEL FUER DIE AUFTRENNUNG VON DNA 28
2.2.5.2. FORMALDEHYD-AGAROSEGEL FUER DIE AUFTRENNUNG
VON RNA 28
2.2.5.3. SEQUENZIERGEL 29
2.2.6. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-SONDEN 29
2.2.6.1. RADIOAKTIVE KINASIERUNG (5'-ENDMARKIERUNG) VON
DNA-SONDEN 29
2.2.6.2. RANDOM PRIMER LABELLING VON DNA-SONDEN 30
2.2.7. TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN 30
2.2.7.1. SOUTHERN BLOT 30
2
.
21
.
2
.
NORTHERN BLOT 31
2.2.8. HYBRIDISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 31
2.2.8.1. SOUTHERN HYBRIDISIERUNG 31
2.2.8.2. NORTHERN HYBRIDISIERUNG 31
2.2.9. KOMPETENTE
E.CO/Z-ZELLEN NACH DER CACL2-METHODE 32
2.2.10. TRANSFORMATION VON "CACL
2-KOMPETENTEN" E.COLI-ZELLEN 32
2.2.11. AUFBEREITUNG SYNTHETISCHER OLIGONUKLEOTIDE 32
2.2.12. SEQUENZIERUNG VON T7-POLYMERASE UND [A
35S]DATP 33
- 111 -
SEITE
2.2.13. REVERSE TRANSKRIPTION MIT NACHFOLGENDER
POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) 34
2.2.13.1. REVERSE TRANSKRIPTION 34
2.2.13.2. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 35
2.2.14. PRAEPARATION POLYKLONALER ANTISEREN 36
2.2.15. WESTERN BLOT ANALYSE 37
2.2.15.1. PROTEINPRAEPARATION AUS GEWEBEN 37
2.2.15.2. PROTEINBESTIMMUNG 37
2.2.15.3. SDS-GELELEKTROPHORESE 38
2.2.15.4. WESTERN BLOT 38
2.2.16. IMMUNHISTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN 39
3. ERGEBNISSE 40
3.1. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES CDNA-
KLONES FUER DMGDH 40
3.1.1. AUSWAHL DER OLIGONUKLEOTIDE 40
3.1.2. STRATEGIE DER UEBERPRUEFUNG MOEGLICH POSITIVER
KLONE 42
3.1.3. ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG EINES FULL LENGTH CDNA-
KLONES FUER DMGDH 44
3.1.4. N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZ 49
3.1.5. DINUKLEOTID-BINDUNGSDOMAENE 51
3.1.6. SEQUENZHOMOLOGIE ZUR FOLATBINDUNGSSTELLE DER
THYMIDYLATSYNTHASE AUS
L.CASEI 53
3.2. ZELLSPEZIFISCHE EXPRESSION DER DMGDH 54
3.2.1. KOMPETITIVE RT-PCR 55
3.2.1.1. KONSTRUKTION EINES INTERNEN STANDARDS 56
3.2.1.2. ZELLSPEZIFISCHE EXPRESSION DER DMGDH-MRNA 59
- IV -
SEITE
3.2.2. WESTERN BLOT ANALYSE 65
3.2.3. IMMUNHISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER DMGDH-EXPRESSION
INNERHALB DER LEBER UND NIERE 66
4. DISKUSSION 70
4.1. DURCHMUSTERUNG DER CDNA-GENBANK 70
4.2. UEBERPRUEFUNG MOEGLICH POSITIVER KLONE 72
4.3. CHARAKTERISIERUNG DER DMGDH-CDNA 73
4.4. BESONDERE ABSCHNITTE DER ABGELEITETEN AMINOSAEUREN
SEQUENZ DER DMGDH 74
4.5. ZELLSPEZIFISCHE EXPRESSION DER DMGDH 75
4.6. ZUSAMMENFASSUNG 77
5. LITERATUR 79
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
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