Regulation und Synthese des Enzyms Glucose Oxidase in dem Pilz Aspergillus niger NRRL3 sowie in weiteren Aspergillus-Spezies:
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| Sprache: | German |
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1994
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
SEITE
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
3.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
14
3.1
ALLGEMEINER
TEIL
14
3.1.1
MATERIALIEN
UND
CHEMIKALIEN
14
3.1.2
ENZYME
UND
PROTEINE
15
3.1.3
GERAETE
UND
SONSTIGE
HILFSMITTEL
15
3.1.4
STERILISATION
VON
GERAETEN,
LOESUNGEN
UND
NAEHRMEDIEN
16
3.1.5
ABSORPTIONSMESSUNG
16
3.1.6
RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNG
16
3.1.7
BESCHREIBUNG
DER
VERWENDETEN
STAEMME
UND
PLASMIDE
17
3.2
KULTIVIERUNG
UND
LAGERUNG
VON
FILAMENTOESEN
PILZEN
18
3.2.1
KULTIVIERUNG
ZUR
GEWINNUNG
VON
MYCEL
UND
SPOREN
18
3.2.2
KULTIVIERUNG
IN
SCHUETTELKULTUR
19
3.2.3
KULTIVIERUNG
IM
FERMENTER
20
3.3
AUFSCHLUSS
VON
ASPERGILLUS-MYCEL
20
3.4
TRANSFORMATION
VON
ASPERGILLI
20
3.5
KULTIVIERUNG
UND
LAGERUNG
VON
E.CO/ASTAEMMEN
22
3.6
TRANSFORMATION
VON
E.CO/ASTAEMMEN
23
3.6.1
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
ZELLEN
23
3.6.2
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
MIT
PLASMIDEN
24
3.7
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
24
3.7.1
PLASMIDPRAEPARATION
IM
GROSSEN
MASSSTAB
24
3.7.2
PLASMIDPRAEPARATION
UEBER
QIAGEN-SAEULEN
25
3.7.3
PLASMIDSCHNELLPRAEPARATION
26
3.8
GELELEKTROPHORESE
VON
NUKLEINSAEUREN
26
3.8.1
LAENGENSTANDARDS
27
3.8.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
27
3.8.3
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
28
3.9
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
3.9.1
PHENOLEXTRAKTION
28
3.9.2
ETHANOLFAELLUNG
29
3.9.3
ISOPROPANOLFAELLUNG
29
3.9.4
ELEKTROELUTION VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
29
UND
LOW
MELTING
AGAROSEGELEN
3.10
ENZYMATISCHE
MODIFIKATIONEN
VON
NUKLEINSAEUREN
30
3.10.1
HYDROLYSEN
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
30
3.10.2
LIGATIONEN
30
3.10.3
5'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
31
3.10.4
ASSOZIATION
VON
EINZELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDEN
ZU
31
DOPPELSTRANG-DNA
3.10.5
"NICK"-TRANSLATION
31
3.11
NACHWEIS
DER
GLUCOSE
OXIDASE
AKTIVITAET
32
3.11.1
NACHWEIS
VON
GLUCOSE
OXIDASE
MIT
EINEM
AGARDIFFUSIONSTEST
32
3.11.1.1
NACHWEIS
DER
SAEUREPRODUKTION
MIT
METHYLROT-INDIKATORMEDIUM
32
3.11.1.2
NACHWEIS
DER
H
2
O
2
-PRODUKTION
AUF
AGARPLATTEN
MIT
ABTS
33
UND O-DIANISIDIN
3.11.2
KINETISCHE
AKTIVITAETSMESSUNG
DER
GLUCOSE OXIDASE
34
3.12
H
2
O
2
-BESTIMMUNG
IN
KULTURUEBERSTAENDEN
37
3.13
PRAEPARATION
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
A.N/GER
NRRL3
38
3.14
TRANSFER
UND
HYBRIDISIERUNG VON
NUKLEINSAEUREN
38
3.14.1
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
38
3.14.2
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
39
3.14.3
HYBRIDISIERUNG
MIT RADIOAKTIV
MARKIERTEN
PROBEN
39
3.15
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
ASPERGILLUS
NIGER
40
3.15.1
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
40
3.15.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
NACH
DENATURIERUNG
40
MIT
GLYOXAL
UND
DMSO
3.16
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
41
3.16.1
KONZENTRIERUNG
DER
KULTURUEBERSTAENDE
MIT
CENTRICON
41
MIKROKONZENTRATOREN
3.16.2
SDS-GELELEKTROPHORESE
42
3.16.3
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS
43
3.16.4
COOMASSIE-UND
SILBERFAERBUNG
43
3.16.5
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
NACH
BRADFORD
44
3.17
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
44
4
ERGEBNISSE
45
4.1
AUSWAHL
DER
STAEMME
UND
SELEKTIONSSYSTEM
45
4.2
AUFBAU
DER
UEBEREXPRESSIONSSYSTEME
FUER
GLUCOSE
OXIDASE
46
4.2.1
GOD-UEBEREXPRESSIONSSYSTEM
MIT
DEM
A-AMYLASE
PROMOTOR
47
4.2.1.1
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
G0D1
47
4.2.1.2
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
G0D2
50
4.2.1.3
TRANSFORMATION
DER
VEKTOREN
IN
A.NIGER
NRRL3
UND
52
A.ORYZAE
POA4
4.2.1.4
QUALITATIVER
AKTIVITAETSTEST
VON
TRANSFORMANTEN
AUF
AGARPLATTEN
53
4.2.1.5
PRAEPARATION
DER
POSITIVEN
TRANSFORMANTEN
IN
EINER
53
SCHUETTELKULTUR
4.2.1.6
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
DER
T
RANSFORMANTEN
55
4.2.2
GOD-UEBEREXPRESSIONSSYSTEM
MIT
DEM
GPD-PROMOTOR
59
AUS
A.NIDULANS
4.2.2.1
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
GOD3
59
4.2.2.2
TRANSFORMATION
DES
VEKTORS
IN
A.NIGER
NRRL3
UND
62
A.NIDULANS
G191
4.2.2.3
QUALITATIVER
AKTIVITAETSTEST
IN
AGARPLATTEN
63
4.2.2.4
SCHUETTELKULTUR
DER
POSITIVEN TRANSFORMANTEN
64
4.2.2.5
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
VON
GOD3-TRANSFORMANTEN
67
4.2.3
GOD-UEBEREXPRESSIONSSYSTEM
MIT
DEM
GPD-PROMOTOR
68
AUS
A.NIGER
4.2.3.1
KONSTRUKTION
DER
EXPRESSIONSVEKTOREN
PGOD4
UND
PGOD5
68
4.2.3.2
TRANSFORMATION
DER
VEKTOREN
IN
A.NIGER
NRRL3
74
4.2.3.3
QUALITATIVER
AKTIVITAETSTEST
IN
AGARPLATTEN
74
4.2.3.4
SCHUETTELKULTUR
DER
POSITIVEN
TRANSFORMANTEN
74
4.2.3.5
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE
DER
TRANSFORMANTEN
78
4.3
MEDIENOPTIMIERUNG
80
4.3.1
OPTIMALER
PH-WERT
FUER
DIE
KULTIVIERUNG
MIT
VERSCHIEDENEN
80
PUFFERSYSTEMEN
4.3.2
VERSUCHE
MIT
VERSCHIEDENEN
MEDIEN
FUER
EINE
OPTIMIERTE
83
EXPRESSION
4.4
UNTERSUCHUNG
UEBER
DIE
KORRELATION
ZWISCHEN
DER
GEN
84
KOPIENZAHL
UND
MRNA-BILDUNG
DURCH
DIE
NORTHEM-BLOT
ANALYSE
4.5
FERMENTATION
87
4.5.1
FERMENTATION
VON
A.NIGER
NRRL3,
TRANSFORMANT
GOD3-1
8
87
UND
GOD4-12
4.5.2
FERMENTATION
DER
GOD3-18-MUTANTE
BEI
VERSCHIEDENEN
90
PARAMETERN
4.5.3
FERMENTATION
MIT
DEM
BESSEREN
MEDIUM
93
4.5.4
PROTEINNACHWEIS
DER
ZEITPROBEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
95
4.5.5
ZUSAMMENFASSUNGEN
DER
FERMENTATIONSERGEBNISSE
96
5.
DISKUSSION
98
6.
LITERATURVERZEICHNIS
107 |
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| topic_facet | Überexpression Glucoseoxidase Proteinsekretion Aspergillus niger Hochschulschrift |
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