Struktur-, Funktionsbeziehungen und Regulation des Hauptkälteschock-Proteins CspB aus Bacillus subtilis:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Marburg
Görich & Weiershäuser
1996
|
| Schriftenreihe: | Wissenschaft in Dissertationen
77 |
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Marburg, Univ., Diss., 1996 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
.
1
2.
EINLEITUNG
.
3
2.1
HITZESCHOCK-ANTWORT
.
3
2.1.1
HITZESCHOCK-ANTWORT
IN
ESCHERICHIA
COLI
.
3
2.2
KAELTESCHOCK-ANTWORT
IN
ESCHERICHIA
COLI
.
5
2.2.1
DAS
KAELTESCHOCK-REGULON
.
5
2.2.2
DAS
HAUPTKAELTESCHOCK-PROTEIN
CSPA
.
6
2.2.3
REGULATION
DER
KAELTESCHOCK-ANTWORT
.
7
2.3
KAELTESCHOCK-ANTWORT
IN
BACILLUS
SUBTILIS
.
10
2.3.1
DAS
HAUPTKAELTESCHOCK-PROTEIN
CSPB
.
10
2.3.2
STRUKTUR
VON
CSPB
.
12
2.3.3
REGULATION
VON
CSPB
.
14
2.4
AUFGABENSTELLUNG
.
15
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
17
3.1.
MIKROORGANISMEN
.
17
3.2.
MEDIEN
.
18
3.3.
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
.
19
3.4
VEKTOREN
.
20
3.4.1
LAMBDA
ZAP
II
.
20
3.4.2
PBLUESCRIPT
II
SK
.
21
3.4.3
PGPL-2
.
22
3.4.4
PBR322
.
23
3.4.5
PJHLOL
.
23
3.4.6
PJL62
.
24
3.4.7
PTKIAC
.
25
3.4.8
PZA327
.
'.
.
26
3.4.9
PTV20
UND
PTV21A2
.
27
3.5
DNA-PRAEPARATION
.
27
3.5.1
PLASMID-DNA
.
27
3.5.2
CHROMOSOMALE
DNA
.
29
3.5.3
EINZELSTRAENGIGE
PHAGEMID-DNA
.
29
3.5.4
EINZELSTRAENGIGE
PLASMID-DNA
.
30
3.6
AUFREINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLLGONUKLEOTIDE
.
30
3.6.1
HPLC-GEREINIGTE
DNA-OLIGOMERE
.
30
3.6.2
DNA-OLIGOMERE
.
31
3.6.3
DNA-OLIGOMERE
MIT
EINER
LAENGE
VON
MEHR
ALS
60
BASEN
.
31
3.6.4
RNA-OLIGOMERE
.
33
3.7
VERDAU
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
3.8
GLAETTEN
VON
UEBERSTEHENDEN
DNA-ENDEN
.
3.9
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
3.10
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
3.11
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
3.12
LIGATION
.
3.13
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
3.13.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
CO/FZELLEN
.
3.13.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
B.
SUBTILIS-ZEWEN
.
3.14
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN-ZELLEN
.
3.14.1
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
3.14.2
TRANSFORMATION
VON
B.
SUBTLLLS
.
3.15
PHAGEN-INFEKTION
.
3.15.1
HERSTELLUNG
VON
MGSO4-ZELLEN
.
3.15.2
LAMBA
PHAGEN-INFEKTION
.
3.15.3
IN
V/VO-EXZISION.
3.16
EXPRESSION
KLONIERTER
GENE
IN
E.
COLI
.
3.17
PRAEPARATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
.
3.18
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
3.19
PROTEINFAERBUNG
.
3.19.1
PROTEINFAERBUNG
MIT
COOMASSIE
BRILLIANT
BLUE
.
3.19.2
PROTEINFAERBUNG
MIT
SILBERNITRAT
.
3.20
PROTEINBESTIMMUNG
.
3.20.1
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
3.20.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
GILL
UND
VON
HIPPEL
.
3.21
BLOTTING-VERFAHREN
.
3.21.1
SOUTHERN-TRANSFER
.
3.21.2
WESTERN-TRANSFER
.
3.22
DNA-MARKIERUNG
MIT
32P-MARKIERTEN
NUKLEOTIDEN
.
3.22.1
ENDMARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
3.22.2
INTRAMOLEKULARE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
3.23
HYBRIDISIERUNGSVERFAHREN
.
3.23.1
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
.
3.23.2
PLAQUE
UND
KOLONIEFILTER-HYBRIDISIERUNG
.
3.24
IMMUNOLOGISCHER
PROTEINNACHWELS
.
3.25
GELRETARDIERUNG
.
II
3.26
RNA-TRANSKRLPTION
.
59
3.27
DNA-SEQUENZIERUNG
.
60
3.28
SEQUENZGELE
.
63
3.29
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
64
3.30
AUFREINIGUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
.
66
3.31
OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE
MUTAGENESE
.
66
3.32
SS-GALAKTOSIDASE
TEST
.
69
3.33
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
MIT
FPLC
.
71
3.33.1
CHROMATOGRAPHIE
MIT
TENTAKEL
ANIONENAUSTAUSCHER
.
71
3.33.2
GELFILTRATION
MIT
SUPERDEX
G-75
.
72
4.
ERGEBNISSE
.
73
4.1
MUTATIONEN
IN
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
HAUPT
KAELTESCHOCK-PROTEINS
CSPB
AUS
BACILLUS
SUBTLLIS
.
73
4.1.1
KONSTRUKTION
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
ZUR
EINFUEHRUNG
VON
PUNKTMUTATIONEN
IN
CSPB
.
75
4.1.2
EINFUEHRUNG
VON
PUNKTMUTATIONEN
IN
DAS
PLASMID
PCSPB3
.
75
4.1.3
UEBERPRODUKTION
DER
MUTIERTEN
PROTEINE
.
76
4.1.4
AUFREINIGUNG
DER
MUTIERTEN
PROTEINE
.
76
4.1.5
NMR-UNTERSUCHUNG
VON
CSPB
UND
MUTIERTEN
PROTEINEN
.
78
4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZU
DNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
CSPB
UND
MUTIERTEN
PROTEINEN
.
79
4.2.1
BINDUNG
VON
CSPB
UND
MUTIERTEN
PROTEINEN
AN
DAS
ELNZELSTRAENGLGE
DNA-OLIGOMER
54YB
.
79
4.2.2
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENTE
VON
CSPB
MIT
DEN
EINZELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDEN
12YB+
UND
8YB+
.
82
4.2.3
KALIBRIERUNG
DER
GELFILTRATIONSSAEULE
SUPERDEX
16/60.
83
4.2.4
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
VON
CSPB
MIT
12YB+
BZW.
8YB+
.
84
4.2.5
U
V-CROSSLINKING
VON
CSPB
MIT
1
2YB+
UND
8YB+
.
85
4.2.6
GEIFILTRATIONSANALYSE
DER
UV-CROSSLINKLNG-ANSAETZE
AUS
CSPB
UND
12YB+
BZW.
8YB+.
86
4.2.7
UV-CROSSLINKING
DER
MUTIERTEN
PROTEINE
MIT
12YB+
UND8YB+
.
88
4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZU
RNA-BINDUNGSEIGENSCHAFTEN
VON
CSPB
.
89
M
4.3.1
GELRETARDIERUNGSEXPERIMENTE
MIT
DEN
OLIGOMEREN
25YB+DNA
SOWIE
25YB+RNA
.
89
4.3.2
BANDSHIFTEXPERIMENTE
MIT
25YB+RNA
UND
25YB+DNA
.
91
4.3.3
BINDUNGSSTUDIEN
ZWISCHEN
CSPB
UND
RNA
MOLEKUELEN
MIT
AUSGEPRAEGTER
SEKUNDAERSTRUKUR
.
96
4.3.4
GEIRETARDIERUNGEN
MIT
54YB_1
RNA
BIS
54YB_7RNA
.
99
4.3.5
KOMPETITIERUNGSVERSUCHE
ZWISCHEN
CSPB,
54YBJRNA
BIS
54YB_7RNA
UND
DNA-OLLGOMEREN
.
101
4.4
IDENTIFIZIERUNG
DES
PROTEINS
CSPR,
DAS
DIE
CSPB
EXPRESSION
BEEINFLUSST
.
102
4.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
AKTIVITAET
DES
CSPSS-PROMOTORS
INGW3
.
103
4.6
IDENTIFIZIERUNG
CSP/?-REKOMBINANTER
LAMBDA-PHAGEN
IN
DER
BACILLUS
SUBTLLIS
LAMBDA
ZAP
II
GENBANK
.
108
4.6.1
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
CSPR
REKOMBINANTER
PBLUESCRIPTLL
SK--PLASMIDE
.
109
4.6.2
KONSTRUKTION
VON
SUBKLONEN
DER
CSP/?-REKOMBIN
ANTEN
PLASMIDE
PCSPR
1,
PCSPR2
UND
PCSPR3
.
111
4.6.3
SEQUENZIERUNG
DER
CSP/?-REKOMBLNANTEN
PLASMIDE
PCSPR
1,
PCSPR2
UND
PCSPR3
.
112
4.6.4
DNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
CSPR-GENS
BZW.
DES
CSPR-PROTEINS
.
113
4.6.5
SEQUENZVERGLEICHE
MIT
CSPR
UND
AMINOSAEURE
SEQUENZEN
DER
UEBRIGEN
OFFENEN LESERAHMEN
.
116
4.7
ENTFERNUNG
DES
CSPR-GENS
AUS
DEM
CHROMOSOM
VON
BACILLUS
SUBTLLIS
JH642
.
120
4.7.1
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
DES
BACILLUS
SUBTLLIS
STAMMES
KS1
.
123
4.8
KONSTRUKTION
DES
BACILLUS
SUBTLLIS
STAMMES
GW3A
.
124
4.8.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
AKTIVITAET
DES
CSPSS-PROMOTORS
LNGW3A
.
126
4.9
UNTERBRECHUNG
DES
CSPR-GENS
IN
GW3A
.
.-.
126
4.9.1
UNTERSUCHUNG
ZUR
AKTIVITAET
DES
CSPSS-PROMOTORS
INKS2
.
128
4.10
EXPRESSION
DES
CSPR-PROTELNS
AUS
BACILLUS
SUBTLLIS
.
129
4.10.1
AUFREINIGUNG
VON
CSPR
AUS
BACILLUS
SUBTLLIS
.
130
4.11
BINDUNGSSTUDIEN
ZWISCHEN
CSPR
UND
DEM
CSPSS-PROMOTOR
.
132
IV
4.12
ENTFERNUNG
DES
CSPSS-GENS AUS
DEM
B.
SUBTLLLS
CHROMOSOM
MITTELS
DOPPELCROSSOVER
REKOMBINATION
.
134
4.13
UNTERSUCHUNG
DER
CSPSS-'KNOCK-OUT'-MUTANTE
KS3
.
137
4.13.1
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNG
VON
KS3
.
137
4.13.2
ANALYSE
DER
KAELTESENSITLVITAET
DER
CSPSS
'
KNOCK-OUF
MUTANTE
KS3
.
138
4.14
EXPRESSION
DES
HAUPTKAELTESCHOCK-PROTEINS
CSPBC
AUS
DEM
THERMOPHLLEN
BACILLUS
CALDOLYTLCUS
.
140
4.10.1
AUFREINIGUNG
VON
CSPBC
AUS
BACILLUS
CALDOLYTLCUS.
.
142
4.15
BINDUNG
VON
CSPBC
AN
DAS
ELNZELSTRAENGLGE
DNA-OLIGOMERE
54YB
.
144
5
DISKUSSION
.
147
5.1
MUTATIONEN
IN
DER
NUKLEINSAEURE-BINDUNGSOBERFLAECHE
VON
CSPB
.
147
5.2
CSPB
-
EIN
DNA
UND
RNA-BLNDENDES
PROTEIN
.
151
5.3
REGULATION
DES
CSPSS-GENS
.
155
5.3.1
CSPR
-
EIN
AKTIVATOR
DES
CSPSS-GENS
.
156
5.3.2
DIE
ROLLE
VON
CSPR
BEI
DER
AKTIVIERUNG
DES
CSPSS-GENS
.
158
5.4
DAS
KAELTESCHOCK-REGULON
IN
BACILLUS
SUBTLLLS
.
161
5.5
SCHLUSSFOLGERUNG
.
163
6.
LITERATUR
.
165
V |
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