In-vitro-Toxizität von Fulleren C 60 und seinen Vorstufen: Einfluß auf Vitalität, Zytokin-Freisetzung und Oxidantienhaushalt
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Karlsruhe
1996
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| Ausgabe: | Als Ms. gedr. |
| Schriftenreihe: | Forschungszentrum <Karlsruhe>: Wissenschaftliche Berichte
5774B |
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| Beschreibung: | Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss. - Zsfassung in engl. Sprache |
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis und Abkürzungsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Material und Methoden
2.1. Untersuchungen der partikulären Zusätze
2.1.1. Kohlenstoff-Stäube
2.1.1.1. Untersuchungen der Partikel mittels Raster-Elektronenmikroskop 11
2.1.1.2. Untersuchungen auf metallische Verunreinigungen mit Röntgenfluoreszenz-
Spektroskopie 11
FullerenC60 12
Fulleren-Rohruß 13
Graphit-Staub 14
2.1.1.3. Untersuchung des Fulleren-Rohrußes mit Röntgenstruktur-Analyse 15
2.1.2 Quarz DQ12 17
2.2. Hämolyse-Test 17
2.3. Inkubationen mit Rinder-Alveolarmakrophagen (RAM) 18
2.3.1. Gewinnung der RAM 18
2.3.2. Kultur der RAM 19
2.3.3. Inkubationsversuche mit RAM zur Freisetzung von Zytokinen 19
Variation der Partikel-Konzentration 20
Variation der Zeit 20
2.3.4. Zellzahlbestimmung und photographische Dokumentation 21
2.4. Inkubation mit differenzierten HL-60-Zellen 21
2.4.1. Kultur der HL-60-Zellen 22
2.4.2. Differenzierung zu makrophagen-ähnlichen Zellen (HL-60-M) 22
2.4.3. Inkubation der HL-60-M mit Partikeln 22
2.4.4. Zellzahlbestimmung 23
2.5. Kultur der BEAS-2B-Zellen 23
2.6. Transmissions-Eletronenmikroskopie (TEM) 25
2.7. Untersuchungen zur Freisetzung intrazellulärer Enzyme: LDH und
NAG 26
2.7.1. Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase (LDH) 26
2.7.2. Bestimmung der N-Acetyl-ß-Glucosaminidase (NAG) 27
2.8. Bestimmung des Tumor-Nekrose-Faktors-a (TNF-a) durch den
WEHI-Bioassay 28
2.8.1. Grundlagen des Verfahrens 28
2.8.2. Kultur der WEHI 164/13-Zellen 28
2.8.3. TNF-a Testverfahren für WEHI-164/13 29
2.9. Bestimmung der chemoattraktiven Faktoren (Chemotaxis) 30
2.9.1. Chemoattraktive Faktoren für RAM 30
2.9.2. Chemoattraktive Faktoren für polymorphonukleäre neutrophile
Granulozyten 32
Inhaltsverzeichnis und Abkürzungsverzeichnis II
2.10. Zytokin-Quantifizierung mit ELISA 33
2.10.1. Allgemeines 33
2.10.1.1. TNF-a 33
2.10.1.2. IL-8 34
2.10.1.3. PDGF-AB 34
2.10.1.4. bFGF 34
2.10.2. Adsorption von Zytokinen an Kohlenstoff-Partikel am Beispiel TNF-a 35
2.11. Untersuchungen zum Oxidantien-/Antioxidantienhaushalt in vitro 35
2.11.1. Nachweise zur in vitro Produktion von Oxidantien 35
2.11.1.1. Oxidantien-Nachweis mit 2 ,7 -Dichlorofluorescin-Diacetat
(H2DCF-DA) 35
Versuchsansatz für RAM 36
Versuchsansatz für HL-60-Makrophagen 37
Versuchsansatz für BEAS-2B-Zellen 37
2.11.1.2. Oxidantiennachweis mit Cytochrom C 37
2.11.2. Bestimmung von Antioxidantien 39
2.11.2.1. Bestimmung des Glutathion (GSH) 39
2.11.2.2. Bestimmung der Superoxid-Dismutase (SOD) 40
2.12. Untersuchungen zur unspezifischen Radikalbildung durch CgQ
und Rohruß im zellfreien System 41
2.12.1. Das a-Keto-S-Methyl-Buttersäure (KMB)-Modell 41
2.12.2. Die Crocin- Bleichung 43
2.13. Datenpräsentation und Statistik 43
3. Ergebnisse 45
3.1. Licht- und transmissions-elektronenmikroskopische
Untersuchungen 45
3.2. Hämolyse 45
3.3. Vitalität, Enzym- und Zytokinfreisetzung aus Rinder-
Alveolarmakrophagen (RAM) 45
3.3.1. Variation der Partikel-Konzentrationen 46
3.3.1.1. Einfluß auf die Zellzahl 46
3.3.1.2. Einfluß auf die Freisetzung der Lactat-Dehydrogenase (LDH) 46
3.3.1.3. Einfluß auf die Freisetzung von Tumor-Nektose-Fator-a (TNF-a) 46
3.3.1.4. Einfluß auf die chemoattraktive Wirkung (CW) der Inkubations¬
überstände für RAM 46
3.3.2. Variation der Inkubationszeiten 47
3.3.2.1. Einfluß auf die Zellzahl 47
3.3.2.2. Einfluß auf die Freisetzung der Lactat-Dehydrogenase (LDH) 47
3.3.2.3. Einfluß auf die Freisetzung der N-Acetyl-/J-Glucosaminidase (NAG) 48
Zeitlicher Verlauf der NAG-Freisetzung unter normalen Inkubationsbedingungen 48
Verlauf der NAG-Freisetzung nach dem Entfernen nicht phagozytierter Partikel 48
3.3.2.4. Einfluß auf die Freisetzung von Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNF-a) 49
3.3.2.6. Einfluß auf die chemoattraktive Wirkung (CW) der Inkubations¬
überstände für RAM 49
Inhaltsverzeichnis und Abkürzungsverzeichnis III
3.3.2.6. Einfluß auf die chemoattraktive Wirkung (CW) der Inkubations¬
überstände für neutrophile Granulozyten 49
3.4. Vitalität und Zytokinfreisetzung aus makrophagenähnlich-
differenzierten HL-60-ZeIlen (HL-60-M) 50
3.4.1. Einfluß auf die Zellzahl 50
3.4.2. Einfluß auf die Freisetzung der Lactat-Dehydrogenase (LDH) 50
3.4.3. Einfluß auf die Freisetzung der Zytokine 51
Einfluß auf die Freisetzung von TNF-a 51
Einfluß auf die Freisetzung von IL-8 51
Einfluß auf die Freisetzung von PDGF 51
Einfluß auf die Freisetzung von bFGF 52
3.5. Induktion von Oxidantien und Antioxidantien 52
3.5.1. Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (RSS) aus RAM 52
3.5.2. Freisetzung von RSS aus HL-60-Makrophagen 53
3.5.3. Fluoreszenz-Induktion durch Partikel-Dispersionen im zellfreien
Ansatz 54
3.5.4. Freisetzung von Oxidantien aus BEAS-2B-Zellen 54
Ergebnisse des Oxidantiennachweises mit Cytochrom C 55
3.5.5. Produktion von Antioxidantien durch BEAS-2B-Zellen 55
Glutathion 55
SOD 55
3.6. Untersuchungen zur unspezifischen Radikalbildung im zellfreien
System 55
3.6.1. Die Abspaltung von Ethen aus a-Keto-S-Methyl-Buttersäure (KMB) 55
3.6.2. Die Bleichung von Crocin 56
4. Diskussion 57
5. Zusammenfassung 67
6. Literatur 69
7. Bezugsquellen für Reagenzien, sonstiges Labormaterial und
Laborgeräte 83
8. Abbildungen 87
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