Entwicklung einer In-situ-Hybridisierung zum Provirusnachweis des Erregers der enzootischen Rinderleukose bei serologisch leukosepositiven und -negativen Rindern:
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Veröffentlicht: |
Aachen
Shaker
1996
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Autor: Albrecht, Catrin
Jahr: 1996
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 3
2.1. Das bovine Leukosevirus 3
2.2. Vorkommen und Verbreitung der enzootischen Rinderleukose 7
2.3. Epidemiologie 7
2.4. Verlaufsformen der enzootischen Rinderleukose und Immunantwort des
infizierten Wirtes 9
2.5. Diagnose 12
2.5.1. Antikörpernachweis 12
2.5.2. Direkter Virusnachweis 13
2.5.3. Molekularbiologische Virusnachweise 14
2.6. Bekämpfung 20
2.7. Sporadische Rinderleukose 21
3. Material und Methoden 22
3.1. Tiermaterial 22
3.2. Verwendete Zellinien 24
3.3. Verwendete Enzyme, Kits, Antikörper, Nukleotide, Nukleinsäuren,
Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Geräte 25
3.4. Verwendete Lösungen 28
3.5. Präparation genomischer DNA aus Zellkulturen, Blut und Gewebe 31
3.6. DNA-Sondenherstellung 32
3.6.1. DNA-Fragmentherstellung durch Spaltung von Plasmid-DNA 32
3.6.2. DNA-Fragmentamplifikation über die PCR 34
3.6.3. DNA-Sondenmarkierung 35
3.7. Southemblot 38
3.8. Vorbereitung der Zellkulrurpräparate für die in situ Hybridisierung 39
3.8.1. Reinigung der Objektträger 39
3.8.2. Anfertigung der Zellkulturpräparate 39
3.9. Unterschiedliche Methoden der in situ Hybridisierung 39
3.9.1. Austestung von DNA-Markierungsvarianten und Hybridisierungssystemen 39
3.9.2. In situ Hybridisierung mit Digowgenin-markierten Sonden; Nachweis mit
Alkalischer Phosphatase-Substratreaktion 43
3.9.3. In situ Hybridisierung nach Behandlung der ZeKkulturpräparate mit Proteinase 44
K
3.9.4. In situ Hybridisierung nach Behandlung der Zellkulturpräparate mit RNase 45
3.9.5 Präparation von Metaphase-Chromosomen 45
3.10. Blutserologische Untersuchungen 46
3.10.1. CaptureELISA 46
3.10.2. Immundiffusionstest 47
3.11. Aufarbeitung von Blut für die Methode der PCR aus Blutzellextrakt 47
3.12. Durchführung der nested PCR 47
3.13. Anlegen von Primärkulturen und Ausstrichen 48
3.13.1. Knochenmarkprimärkulturen und Knochenmarkausstriche 48
3.13.2. Lymphknoten- und Nierenzellprimärkulturen 49
3.13.3. Leukozytenkurzzeitkultur 50
3.14. Anfertigung und Behandlung von Paraffinschnitten für die in situ 50
Hybridisierung
4. Ergebnisse 52
4.1. Southemblot 52
4.2. In situ Hybridisierung von Zellkulturpräparaten 53
4.3. Untersuchung von Rindern zum serologischen Leukosestatus und zum BLV- 67
Provirusgehalt
4.4. In situ Hybridisierung von Primärkulturen und Ausstrichen der untersuchten 74
Tiere
4.4.1. Untersuchung der Knochenmarkprimärkulturen und Knochenmarkausstriche 74
4.4.2. Untersuchung der Lymphknotenprimärkulturen 76
4.4.3. Untersuchung der Leukozytenkurzzeitkultur vom Tier 9 78
4.4.4. Untersuchung der Nierenkultur vom Tier 9 78
4.5. Ergebnisse der in situ Hybridisierung von Gewebeschnitten 80
5. Diskussion 91
5.1. Untersuchungen an permanenten Zellkulturen mittels Southernblotanalyse auf
Vorhandensein von BLV-Provirussequenzen 91
5.2. Versuche zur Optimierung der in situ Hybridisierung von Zellkulturpräparaten
permanenter Zellinien 93
5.3. Untersuchungen zum serologischen Leukosestatus der Tiere mittels ELISA und
IDT sowie zum Provirusgehalt in Blutzellen mittels PCR 10°
5.4. Untersuchungen mittels in situ Hybridisierung an Gewebezellkuituren,
Ausstrichen und Gewebeschnitten sowie mittels PCR an genomischer DNA 102
ausgewählter Organe
6. Zusammenfassung 109
7. Slimmnry 111
8. Literaturverzeichnis 113
Danksagung
Lebenslauf
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