Untersuchungen zur Biogenese und Funktion mitochondrialer Hämlyasen:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
INTRAZELLULAERER
PROTEINTRANSPORT
.
1
1.2.
PROTEINIMPORT
IN
DIE
MITOCHONDRIEN
.
2
1.3.
DER
MITOCHONDRIALE
IMPORTAPPARAT
.
4
1.3.1.
DER
IMPORTAPPARAT
DER
AUSSENMEMBRAN
(MOM-KOMPLEX)
.
4
1.3.2.
DER
IMPORTAPPARAT
DER
INNENMEMBRAN
(MIM-KOMPLEX)
.
5
1.4.
MECHANISMUS
UND
ENERGETIK
DES
PROTEINIMPORTS
IN
DIE
MATRIX
.7
1.4.1.
MITOCHONDRIALE
PRAEPROTEINE
IM
CYTOSOL
.
7
1.4.2.
ERKENNUNG
UND
TRANSPORT
UEBER
DIE
MITOCHONDRIALE
AUSSENMEMBRAN
.
7
1.4.3.
TRANSPORT
UEBER
DIE
MITOCHONDRIALE
INNENMEMBRAN
.
9
1.4.4.
PROZESSIERUNG
UND
FALTUNG
.
10
1.5.
INTRAMITOCHONDRIALE
SORTIERUNG
VON
PRAEPROTEINEN
.
11
1.5.2.
DIE
SORTIERUNG
VON
PROTEINEN
IN
DEN
INTERMEMBRANRAUM
.
13
1.5.3.
DER
IMPORTWEG
DER
CYTOCHROM
C
HAEMLYASE
.
15
1.5.4.
DER
IMPORTWEG
DES
CYTOCHROM
C
.
15
1.6.
MITOCHONDRIALE
HAEMLYASEN
.
16
1.6.1.
DIE
ROLLE
DER
HAEMLYASEN
IN
DER
BIOGENESE
DER
CYTOCHROME
C
UND
C]
.
16
1.6.2.
FUNKTIONELLE
BEREICHE
DER
HAEMLYASEN
.
17
1.7.
PROBLEMSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
.
18
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
20
2.1.
REKOMBINANTE
DNS-TECHNIKEN
.
20
2.1.1.
PRAEPARATION
VON
DNS
.
20
2.1.2.
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
DNS
.
22
2.1.2.1.
PHENOLEXTRAKTION
UND
ETHANOLFAELLUNG
.
22
2.1.2.2.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
23
2.1.2.3.
ISOLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
23
2.1.3.
ENZYMATISCHE
MODIFIKATION
VON
DNS
.
24
2.1.3.1.
SPALTUNG
VON
DNS
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
24
2.1.3.2.
MODIFIKATION
VON
3'
ODER
5
'-UEBERHAENGENDEN
DNS-ENDEN
.
25
2.1.3.3.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS
.
25
2.1.3.4.
LIGATION
VON
DNS
.
26
2.1.4.
TRANSFORMATION
VON
MIKROORGANISMEN
MIT
REKOMBINIERTER
DNS
.
26
2.1.4.1.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
26
2.
1
.4.2.
TRANSFORMATION
VON
S.
CEREVISIAE
.
27
2.2.
BIOCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
28
2.2.1.
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
.
28
2.2.1.1.
SYNTHESE
VON
MITOCHONDRIALEN
PRAEPROTEINEN
IN
VITRO
.
28
2.2.1.2.
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
.
29
2.2.2.
ANALYSE
VON
PROTEINEN
.
30
2.2.2.1.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTOPHORESE
(SDS-PAGE)
.
30
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.2.22.
FLUOROGRAPHIE
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
31
2.2.2.3.
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
(WESTERN-BLOT)
.
31
2.2.2.4.
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
ANTISEREN
.
32
2.2.2.5.
IMMUNDEKORATION
.
33
2.22.6.
NACHWEIS
VON
PROTEIN-GEBUNDENEN
HAEM
.
34
2.2.2.7.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
34
2.3.
ZELIBIOLOGISCHE
METHODEN
.
34
2.3.1.
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
S.
CEREVISIAE
.
34
2.3.2.
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIALEN
ROHEXTRAKTEN
.
35
2.3.3.
IMPORT
IN
VITRO
SYNTHETISIERTER
PRAEPROTEINE
IN
ISOLIERTE
MITOCHONDRIEN
.
36
2.3.4.
SUBFRAKTIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
DURCH
OSMOTISCHEN
SCHOCK
.
37
2.3.5.
FRAKTIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
DURCH
ALKALISCHE
EXTRAKTION
37
2.3.6.
PROTEASE-VORBEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
38
2.3.7.
DEPLETION
DES
MEMBRANPOTENTIALS
AT
.
38
2.3.8.
ATP-DEPLETION
VON
MITOCHONDRIEN
UND
RETIKULOCYTENLYSAT
.
39
2.4.
KONSTRUKTION
VON
PLASMIDEN
UND
HEFESTAEMMEN
.
40
2.4.1.
PLASMIDKONSTRUKTIONEN
.
40
2.4.2.
KONSTRUKTION
VON
HEFESTAEMMEN
.
41
2.5.
VERWENDETE
STAEMME
VON
E.
COLI
UND
S.
CEREVISIAE
.
41
2.6.
MEDIEN
.
42
2.6.1.
E.
CO/I-MEDIEN
.
42
2.6.2.
S.
CEREVISIAE-MEDIEN
.
42
2.7.
CHEMIKALIEN
UND
GERAETE
.
43
2.7.1.
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
43
2.7.2.
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
44
3.
ERGEBNISSE
.
46
3.1.
DER
IMPORTWEG
DER
HAEMLYASEN
IN
DEN
INTERMEMBRANRAUM
.
46
3.1.1.
IMPORT
VON
CCHL
UND
CCIHL
IN
MITOCHONDRIEN
.
46
3.1.2.
DIE
KINETIK
DES
IMPORTS
VON
CCHL
UND
CCIHL
.
46
3.1.3.
REZEPTORABHAENGIGKEIT
DES
CCHL
UND
CCIHL-IMPORTS
.
47
3.1.4.
LOKALISIERUNG
DER
HAEMLYASEN
IM
INTERMEMBRANRAUM
.
50
3.1.5.
UNABHAENGIGKEIT
DES
IMPORTS
VON
CCHL
UND
CCIHL
VON
AH*.
.54
3.1.6.
UNABHAENGIGKEIT
DES
IMPORTS
VON
CCHL
UND
CC
IHL
VON
ATP
.55
3.2.
DIE
FALTUNG
DER
HAEMLYASEN
IM
INTERMEMBRANRAUM
.
57
3.2.1.
IDENTIFIZIERUNG
GEFALTETER
DOMAENEN
IN
CCHL
UND
CC
I
HL
.
57
3.2.2. DIE
FALTUNG
DER
CC
I
HL
NACH
IMPORT
.
58
3.2.3.
KINETIK
DERCCIHL-FALTUNG
.
60
3.2.4.
ABHAENGIGKEIT
DER
CCIHL-FALTUNG
VON
AEUSSEREN
ENERGIEQUELLEN
.
62
INHALTSVERZEICHNIS
III
3.2.5.
EINFLUSS
VON
CYCLOSPORIN
A
UND
FK506
AUF
DIE
CCJHL
FALTUNG
.
62
3.2.6.
IMPORT
DES
GEFALTETEN
25
KDA-FRAGMENTS
IN
DIE
MITOCHONDRIEN
.65
3.3.
DIE
HAEMBINDUNGSSTELLE
DER
HAEMLYASEN
.
68
3.3.1.
HERSTELLUNG
EINER
HEFEMUTANTE
MIT
EINER
CPV-DELETION
IN
CCIHL
.
68
3.3.2.
EINFLUSS
DES
CPV-MOTIVS
AUF
DIE
FUNKTION
DER
CCIHL
.
70
3.3.3.
EINFLUSS
DER
CPV-DELETION
AUF
DIE
PROZESSIERUNG
VON
CYTOCHROM
CI
.
70
3.3.4.
EINFLUSS
VON
HAEM
AUF
DIE
PROTEASE-SENSITIVITAET
DER
CC
[HL
.
73
3.3.5.
EINFLUSS
VON
HAEM
AUF
DIE
RUECKFALTUNG
DER
CCIHL
.
77
3.3.6.
EINFLUSS
VON
HAEM
AUF
DEN
IMPORT
VON
CC
]
HL
UND
CCIHLACPV
.
79
4.
DISKUSSION
.
82
4.1.
DER
IMPORTWEG
DER
HAEMLYASEN
AUS
HEFE
.
83
4.2.
DIE
FALTUNG
DER
HAEMLYASEN
IM
INTERMEMBRANRAUM
.
84
4.3.
DIE
TRIEBKRAFT
DES
HAEMLYASE-LMPORTS
.
86
4.4.
DIE
WECHSELWIRKUNG
DER
HAEMLYASEN
MIT
HAEM
.
89
4.5.
DIE
FUNKTION
DES
CPV-MOTIVS
IN
HAEMLYASEN
.
90
4.6.
DIE
ROLLE
DES
CPV-MOTIVS
IN
ANDEREN
HAEM-BINDENEN
PROTEINEN
.
92
4.7.
BAKTERIELLE
HAEMLYASEN
.
94
4.8.
AUSBLICK
.
95
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
97
6.
LITERATUR
.
100 |
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