Molekulare Charakterisierung der Wirtszellspezifität der DNA-Replikation von Papovaviren:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1995 |
| Beschreibung: | 200 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSANGABE
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DIE
DNA-REPLIKATION
VON
PAPOVAVIREN
.
2
1.1.1
T-ANTIGEN
UND
DER
VIRALE
REPLIKATIONSURSPRUNG
.
2
1.1.2
SPEZIESSPEZIFITAET
DER
DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
.
5
1.1.3
MECHANISMUS
DER
VIRALEN
DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
.
6
1.2
ZELLULAERE
REPLIKATIONSPROTEINE
.
7
1.3
AUFGABENSTELLUNG
.
15
2
MATERIAL
.
16
2.1
ZELLINIEN
.
16
2.1.1.
SAEUGERZELLINIEN
.
16
2.1.2
INSEKTENZELLINIEN
.
16
2.2
BAKTERIENSTAENUNE
.
16
2.3
PHAGEN-CDNA-BANKEN
.
17
2.4
BACULOVIREN
.
17
2.5
PLASMIDE
.
17
2.6
ANTIKOERPER
.
18
2.7
OLIGONUKLEOTIDE
.
19
2.8
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
21
2.9
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
.
21
2.10
ENZYME
.
21
2.11
SAEULENMATERIALEN
.
22
2.12
KITS
.
22
2.13
GERAETE
.
22
2.14
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMITTEL
.
23
2.15
MEDIEN
.
24
2.16
PUFFER
.
24
2.17
COMPUTERPROGRAMME
.
24
3
METHODEN
.
25
3.1
ZELLKULTUR
.
25
3.1.1
KULTIVIERUNG
VON
SAEUGERZELLEN
.
25
3.1.2
KULTIVIERUNG
VON
INSEKTENZELLEN
.
26
3.1.3
EINFRIEREN,
LAGERUNG
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
.
26
3.2
ARBEITEN
MIT
BAKTERIEN
.
27
3.2.1
HERSTELLUNG
PHAGENKOMPETENTER
BAKTERIEN
.
27
3.2.2
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
BAKTERIEN
.
27
3.2.3
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
28
33
ARBEITEN
MIT
PHAGEN
.
28
3.3.1
TITERBESTIMMUNG
VON
PHAGENSTAMMLOESUNGEN
.
28
3.3.2
DURCHMUSTERUNG
EINER
XGT
1
1-CDNA-BIBLIOTHEK
.
29
3.3.3
AUFREINIGUNG
VON
PHAGEN-DNA
.
30
3.4
ARBEITEN
MIT
RNA
.
31
3.4.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
SAEUGERZELLEN
.
31
3.4.2
DENATURIERENDE
AGAROSE/FORMALDEHYD
GELELEKTROPHORESE
.
32
3.4.3
AUFREINIGUNG
VON
MRNA
UEBER
OLIGO
(DT)
ZELLULOSE
.
33
3.5
ARBEITEN
MIT
DNA
.
33
3.5.1
CDNA-SYNTHESE
DURCH
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
.
33
3.5.2
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
34
3.5.2.1
AMPLIFIKATION
DES
5'-ENDESEINES
GENS
(5-RACE)
.
35
3.5.2.2
AMPLIFIKATION
DES
3'-ENDES
EINES
GENS
(3-RACE)
.
36
3.5.2.3
KONSTRUKTION
DEGENERIERTER
PRIMER
.
36
3.5.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
37
3.5.3.1
EINZELKOLONIEGEL
.
37
3.5.3.2
SCHNELLPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
38
3.5.3.3
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
UEBER
IONENAUSTAUSCHER-SAEULEN
.
38
3.5.3.4
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
MIT
HILFE
DER
CSCL
-
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
39
3.5.4
ANALYSE
VON
DNA
.
39
3.5.4.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
39
3.5.4.2
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
39
3.5.4.2.
1
NEUTRALE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
39
3.5.4.2.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
PRAEPARATIVEN
AGAROSEGELEN
.
40
3.5.4.2.3
ALKALISCHE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
40
3.5.4.3
SEQUENZANALYSE
VON
DNA
.
41
3.5.5.3
"RANDOM-PRIMED'-MARKIERUNG
VON
DNA
.
43
3.5.5.4
AUFFUELLEN
VON
5'-UEBERHAENGENDEN
ENDEN
.
43
3.5.5.5
ENTFERNEN
VON
3
'
-UEBERHAENGENDEN
ENDEN
.
43
3.5.5.6
DEPHOSPHORYLIERUNG
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
43
3.5.5.7
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
43
3.6
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
PROTEINEN
.
44
3.6.1
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
.
44
3.6.1.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DURCH
UV-ABSORPTION
BEI
280
NM
.
44
3.6.1.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
MIT
COOMASSIE-BRILLIANT-BLUE
(BRADFORD,
1976).
44
3.6.2
DETEKTION
VON
PROTEINEN
DURCH
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE)
.
44
3.6.2.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
44
3.6.2.2
COOMASSIEFAERBUNG
.
45
3.6.2.3
SILBERFAERBUNG
.
46
3.6.2.4
WESTEMBLOT
.
46
3.7
DAS
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
.
47
3.7.1
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
BACULOVIREN
.
47
3.7.2
PLAQUEASSAY
.
48
3.7.3
AMPLIFIKATION
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
.
48
3.7.4
IDENTIFIKATION
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
.
48
3.7.5
TITERBESTIMMUNG
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
.
49
3.7.6
LAGERUNG
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
.
49
3.7.7
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IM
BACULO-EXPRESSIONSSYSTEM
.
49
3.7.8
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
.
49
3.8
AUFREINIGUNG
VON
PROTEINEN
.
50
3.8.1
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPERSAEULEN
.
50
3.8.1.1
REINIGUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
50
3.8.1.2
KOPPLUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
AN
CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
.
51
3.8.2
REINIGUNG
REKOMBINANTER
KOMPLEXE
DER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
AUS
INSEKTENZELLEN
.
52
3.8.2.1
IMMUNREINIGUNG
VON
KOMPLEXEN
MIT
MURINER
P
1
80-UNTEREINHEIT
DER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
52
3.8.2.2
IMMUNREINIGUNG
VON
KOMPLEXEN
MIT
HUMANER
PL80-UNTEREINHEIT
DER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
54
3.8.3
AUFREINIGUNG
DER
MURINEN
P68-UNTEREINHEIT
DER
DNA
.
55
3.8.4
AUFREINIGUNG
VON
POLYOMA-T-ANTIGEN
AUS
INSEKTENZELLEN
.
56
3.8.5
AUFREINIGUNG
VON
RP-A
AUS
KALBSTHYMUS
.
57
3.9
ZELLEXTRAKTE
.
60
3.9.1
SLOO-EXTRAKT
.
60
3.9.1.1
SLOO-EXTRAKT
AUS
SAEUGERZELLEN
.
60
3.9.1.2
SLOO-EXTRAKT
AUS
INSEKTENZELLEN
.
61
3.9.2
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE-DEPLETIERTER
S
100-EXTRAKT
.
61
3.10
AKTIVITAETSTESTS
.
62
3.10.1
POLYMERASE
A-AKTI
VITAETSTEST
.
62
3.10.2
PRIMASE-AKTI
VITAETSTEST
.
62
3.11
DNA-SYNTHESE
AUF
M13-SSDNA
(M13-REPLIKATION)
.
63
3.12
IN
VITRO
INITIATIONS-REAKTIONEN
.
64
3.12.1
POLYOMA-INITIATION
IN
VITRO
.
65
3.12.2
SV40-INITIATION
IN
VITRO
.
66
3.12.3
ANALYSE
DER
INITIATIONSPRODUKTE
DURCH
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
.
66
3.13
IN
VITRO
REPLIKATIONEN
.
66
3.13.1
POLYOMA-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
.
67
3.13.2
SV40-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
.
69
4
ERGEBNISSE
.
70
4.1
KLONIERUNG
DER
CDNA
DER
KATALYTISCHEN
UNTEREINHEIT
PL80
VON
MURINER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
70
4.1.1
DURCHMUSTERUNG
EINER
AEGT
11
-PHAGENBIBLIOTHEK
UND
KLONIERUNG
DER
PHAGENKLONE
LA
UND
3B
.
71
4.1.1.1
AMPLIFIKATION
DER
PROBE
POL
A
1
-POL
A
2K
.
71
4.1.1.2
DURCHMUSTERUNG
DER
PHAGENBIBLIOTHEK
.
72
4.1.2
KLONIERUNG
DER
PCR
PRODUKTE
PFF
1
AR
UND
PFF-2K
.
73
4.1.3
KLONIERUNG
DES
PCR
PRODUKTES
POL
AA-POL
A5K
.
76
4.1.4
KLONIERUNG
DES
5'-ENDES
DER
DNA-POLYMERASE-A
.
78
4.1.5
KLONIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
PF3BF-POL
A4K
UND
POL
A
1
-POLA4K
.
80
4.1.6
KLONIERUNG
DES
3'-ENDES
DER
DNA-POLYMERASE-A
.
83
4.1.7
ZUSAMMENSETZEN
DER
EINZELNEN
KLONIERTEN
CDNA-FRAGMENTE
ZU
EINEM
VOLLSTAENDIGEN
CDNA-KLON
DER
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A
.
84
4.2
KLONIERUNG
EINES
TEILKLONS
DER
P68-UNTEREINHEIT
DER
BOVINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
ABGELEITET
AUS
DATEN
EINER
AMINOSAEURESEQUENZIERUNG
.
87
4.3
KLONIERUNG
DER
P68-UNTEREINHEIT
DER
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
90
4.4
EXPRESSION
DER
PL80-UNTEREINHEIT
IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
UND
AUFREINIGUNG
VON
AKTIVER
MURINER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
94
4.4.1
KLONIERUNG
DER
CDNA'S
DER
MURINEN
P
180
UND
P68-UNTEREINHEITEN
IN
BACULOTRANSFERVEKTOREN
.
94
4.4.2
OPTIMIERUNG
DER
EXPRESSION
DER
MURINEN
PL80-UNTEREINHEIT
.
95
4.4.3
REINIGUNG
VON
REKOMBINANTEN
KOMPLEXEN
DER
MURINEN
DNA
POLYMERASE
A-PRIMASE
DURCH
MONOKLONALE
ANTIKOERPERSAEULEN
.
98
4.5
REINIGUNG
DER
(HIS)6-P68-UNTEREINHEIT
DER
MURINEN
DNA
POLYMERASE-A-PRIMASE
UEBER
NICKELSAEULE
.
103
4.6
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEN
HYBRIDEN
KOMPLEXEN
DER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
105
4.7
FUNKTIONELLE
UNTERSUCHUNGEN
AN
REKOMBINANTEN
DNA
POLYMERASE-A-PRIMASEN
.
108
4.7.1
DE
NOVO
DNA-SYNTHESE
AUF
NICHT
GEPRIMTER
M13-SSDNA
.
108
4.7.2
REPLIKATION
VON
POLYOMA-DNA
IN
VITRO
.
111
4.8
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SPEZIESSPEZIFITAET
DER
REPLIKATION
VON
POLYOMA-DNA
IN
VITRO
.
114
4.8.1
POLYOMA-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
IN
DEPLETIERTEM
HUMANEN
ZELLEXTRAKT
.
114
4.8.2
DIE
INITIATION
DER
POLYOMA-DNA-REPLIKATION
.
118
4.8.2.1
KONTROLLREAKTIONEN
FUER
DIE
INITIATION
DER
POLYOMA-DNA-REPLIKATION
.
118
4.8.2.2
INITIATION
DER
DNA-REPLIKATION
AM
POLYOMA-REPLIKATIONSURSPRUNG
.
119
4.9
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SPEZIESSPEZIFITAET
DER
SV40-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
.
123
4.9.1
SV40-INITIATIONS
VERSUCHE
.
123
4.9.1.1
KONTROLLEN
FUER
DIE
SV40-INITIATIONSVERSUCHE
.
123
4.9.1.2
INITIATION
DER
SV40-DNA-REPLIKATION
DURCH
DIE
REKOMBINANTEN
KOMPLEXE
HHMM
UND
MMHH
.
124
4.9.1.3
INITIATION
DER
SV40-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
DURCH
DIE
REKOMBINANTEN
KOMPLEXE
HMHH,
MHHH,
HMMM
UND
MHMM
.
126
4.9.2
IN
VITRO
DNA-REPLIKATIONEN
VON
SV40-DNA
.
129
4.9.2.1
OPTIMIERUNG
DER
SV40-DNA-REPLIKATION
IN
DEPUTIERTEN
MAUS-ZELLEXTRAKTEN
129
4.9.2.2
KONTROLLREAKTIONEN
FUER
DIE
SV40-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
IN
DEPUTIERTEN
FM3A-ZELLEXTRAKTEN
.
131
4.9.2.3
REPLIKATION
VON
SV40-DNA
IN
VITRO
DURCH
DIE
REKOMBINANTEN
KOMPLEXE
HHMM
UND
MMHH
.
133
4.9.2.4
IN
VITRO
DNA-REPLIKATION
VON
SV40-DNA
MIT
HILFE
DER
HYBRIDEN
DNA
POLYMERASE-A-PRIMASE-KOMPLEXE
HMHH,
MHHH,
HMMM
UND
MHMM.
135
4.10
DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
IN
INSEKTENZELLEXTRAKTEN
.
138
4.10.1
KONTROLLREAKTIONEN
FUER
DIE
IN
VITRO
DNA-REPLIKATIONEN
IN
INSEKTENZELLEN
.
140
4.10.2
SPEZIESSPEZIFITAET
DER
SV40
UND
POLYOMA-DNA-REPLIKATION
IN
VITRO
IN
INSEKTENZELLEN
.
144
5
DISKUSSION
.
146
5.1
KLONIERUNG
DER
PL80-UNTEREINHEIT
DER
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
146
5.2
KLONIERUNG
DER
P68-UNTEREINHEITEN
DES
DNA-POLYMERASE-A
PRIMASE-KOMPLEXES
.
148
5.3
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
VON
REKOMBINANTEN
KOMPLEXEN
DER
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
149
5.4
SPEZIESSPEZIFITAET
DER
DNA-REPLIKATION
VON
POIYOMA-DNA
IN
VITRO
.
151
5.S
SPEZIESSPEZIFITAET
DER
DNA-REPLIKATION
VON
SV40-DNA
IN
VITRO
.
154
6
ZUSAMMENFASSUNG
.
161
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
162
8
LISTE
DER
ABKUERZUNGEN
.
174
9
ANHANG
.
177
ANHANG
1
DEGENERIERTE
PRIMER,
DIE
VON
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
VERSCHIEDENER
SPEZIES
ABGELEITET
WURDEN
.
177
ANHANG
2
DNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
DER
PL80-UNTEREINHEIT
DER
MURINEN
DNA
POLYMERASE-A-PRIMASE
(DDBJ
UND
EMBL
#
D17384)
.
178
ANHANG
3
RESTRIKTIONSKARTE
DER
CDNA
DER
P
1
80-UNTEREINHEIT
VON
MURINER
DNA
POLYMERASE-A-PRIMASE
.
179
ANHANG
4
CDNA
UND
AMINOSAEURESEQUENZ
DER
P68-UNTEREINHEIT
DER
MURINEN
DNA
POLYMERASE-A-PRIMASE
.
196
ANHANG
5
AMINOSAEUREVERGLEICH
DER
P
1
80-UNTEREINHEIT
DER
HUMANEN
UND
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
197
ANHANG
6
AMINOSAEUREVERGLEICH
DER
P68-UNTEREINHEIT
DER
HUMANEN
UND
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
198
ANHANG
7
AMINOSAEUREVERGLEICH
DER
P58-UNTEREINHEIT
DER
HUMANEN
UND
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
199
ANHANG
8
AMINOSAEUREVERGLEICH
DER
P48-UNTEREINHEIT
DER
HUMANEN
UND
MURINEN
DNA-POLYMERASE-A-PRIMASE
.
200 |
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