Charakterisierung der ektopen Expression lymphocyten-spezifischer Gene in colorectalen Tumorzellinien:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 220 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
MARC
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
ENTSTEHUNG
UND
ENTWICKLUNG
COLORECTALER
TUMOREN
1
1.2.
BETEILIGUNG
VON
PROTO-ONCOGENEN
AN
DER
SIGNALTRANSDUKTION
5
1.3.
PROTEIN-TYROSIN-KINASEN
6
1.3.1.
DIE
SRC-FAMILIE
VON
PROTEIN
TYROSIN
KINASEN
7
ICK
1.4.
DIE
LYMPHOCYTEN-SPEZIFISCHE
PROTEIN-TYROSIN-KINASE
P56
8
ICK
_
1.4.1.
STRUKTUR
VON
P56
8
1.4.2.
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
VON
P56
IN
T-LYMPHOCYTEN
10
1.4.2.1.
BETEILIGUNG
AN
DER
ANTIGEN-STIMULIERTEN
SIGNALTRANSDUKTION
BEI
DER
T-ZELL-AKTIVIERUNG
10
1.4.2.2.
FUNKTION
VON
P56
TE
*
BEI
DER
THYMOCYTEN-DIFFERENZIERUNG
12
1.4.3.
REGULATION
DER
EXPRESSION
DES
FCK-PROTO-ONCOGENS
AUF
MOLEKULARER
EBENE
14
1.4.3.1.
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
DURCH
DIE
VERWENDUNG
ALTERNATIVER
PROMOTOREN
14
1.4.3.2.
POSTTRANSKRIPTIONALE
KONTROLLE
DER
/CK-EXPRESSION
16
1.4.3.3.
KONTROLLE
DER
AKTIVITAET
VON
P56
,CK
17
1.4.4.
ONCOGENE
TRANSFORMATION
DURCH
AKTIVIERUNG
VON
P56
/C
*
18
1.5.
METASTASIERUNG
VON
TUMOREN
20
1.5.1.
MOLEKULARE
MECHANISMEN
DER
METASTASIERUNG
20
1.5.2.
GENETISCHE
FAKTOREN
BEI
DER
METASTASIERUNG
21
1.5.2.1.
BEDEUTUNG
VON
CD44
FUER
DIE
TUMORPROGRESSION
UND
METASTASIERUNG
23
1.6.
PROBLEMSTELLUNG
DER
ARBEIT
25
2.
MATERIAL
27
2.1.
ARBEITSGERAETE
27
2.2.
CHEMIKALIEN
30
2.3.
PUFFER,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
31
2.4.
MEDIEN
FUER
DIE
BAKTERIENKULTUR
32
2.5.
MEDIEN,
MEDIENZUSAETZE
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
ZELLKULTUR
33
2.6.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
34
2.6.1.
ORGANISMEN
34
2.6.1.1.
EUKARYONTEN
34
2.6.1.1.1.
ZELLINIEN
34
2.6.1.2.
PROKARYONTEN
36
2.6.1.2.1.
E.CO/J-STAEMME
36
2.6.2.
PLASMIDE
37
2.6.2.1.
KLONIERUNGSVEKTOREN
37
2.6.2.2.
PROKARYONTISCHE
EXPRESSIONSVEKTOREN
37
2.6.2.3.
EUKARYONTISCHE
EXPRESSIONSVEKTOREN
38
2.6.3.
PRIMER
39
2.6.4.
ENZYME
42
2.6.5.
REAKTIONSSYSTEME
43
2.6.6.
SEROLOGISCHE
REAGENZIEN
44
3.
METHODEN
46
3.1.
ZELLKULTURMETHODEN
46
3.1.1.
KULTUR
VON
E.
COLI
46
3.1.1.1.
FLUESSIGKULTUR
46
3.1.1.2.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
MIT
CALCIUMCHLORID
46
3.1.1.3.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
MIT
TSS-LOESUNG
46
3.1.1.4.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
CO//-ZELLEN
47
3.1.1.5.
LANGZEITAUFBEWAHRUNG
VON
E.COFRZELLEN
47
3.1.2.
KULTUR
EUKARYONTISCHER
ZELLINIEN
47
3.1.2.1
SUBKULTIVIEREN
UND
ERNTEN
VON
ZELLEN
47
3.1.2.2.
LANGZEITAUFBEWAHRUNG
VON
LEBENDEN
ZELLEN
48
3.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA
49
3.2.1.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
49
3.2.1.1.
SCHNELLPRAEPARATION
VON
KLEINEN
MENGEN
PLASMID-DNA
("MINI
PREP
"
)
49
3.2.1.2.
GROSSPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
UND
REINIGUNG
DURCH
GLEICHGEWICHTSZENTRIFUGATION
UEBER
EINEN
CSCI-EBR
DICHTEGRADIENTEN
49
3.2.1.3.
SCHNELLPRAEPARATION
MIT
QIAGEN-ZGENOMED
DNA
MINI
ODER
MAXI-KIT
50
3.2.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
50
3.2.2.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
TRANSIENT
TRANSFIZIERTEN
EUKARYONTENZELLEN
51
3.3.
REAKTIONEN
MIT
DNA-MODIFIZIERENDEN
ENZYMEN
52
3.3.1.
RESTRIKTION
VON
DNA
52
3.3.2.
ENDREPARATUR
MIT
DNA-POLYMERASE
I
(KLENOW)
52
3.3.3.
LIGATION
MIT
T4-DNA-LIGASE
53
3.3.4.
PHOSPHORYLIERUNG
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE
53
3.4.
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
54
3.5.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
56
3.6.
SEQUENZANALYSE
VON
DNA
58
3.6.1.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
MIT
T7-DNA
POLYMERASE
58
3.6.2.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRAENGIGEN
DNA-FRAGMENTEN
MITTAQ
POLYMERASE
MIT
HILFE
DES
FMOLYY
DNA
SEQUENCING
SYSTEM
DER
FIRMA
PROMEGA
60
3.7.
GELELEKTROPHORESE
VON
DNA
62
3.7.1.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
63
3.7.2.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
63
3.7.2.1.
NICHTDENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELE
63
3.7.2.2.
DENATURIERENDE
6%
POLYACRYLAMID/
7M
HARNSTOFF-GELE
64
3.8.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
65
3.8.1.
BINDUNDUNG
AN
DEAE-ZELLULOSE
65
3.8.2.
QIAQUICK GELEXTRAKTIONSKIT
66
3.8.3.
JETSORB
GELEXTRAKTIONSKIT
66
3.9.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
SAEUGERZELLEN
67
3.10.
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
IN
DENATURIERENDEN
FORMALDEHYD/
AGAROSEGELEN
68
3.11.
ANALYSE
VON
TRANSKRIPTEN
DURCH
REVERSE
TRANSKRIPTASE
PCR
(RT-PCR)
69
3.12.
HYBRIDISIERUNGSANALYSEN
72
3.12.1.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
FESTE TRAEGERMATERIALIEN
72
3.12.1.1.
KAPILLARBLOT
VON
UEBER
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
GROESSENFRAKTIONIERTEN
NUKLEINSAEUREN
72
3.12.1.2.
TRANSFER
VON
UEBER
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
AUFGETRENNTEN
DNA-FRAGMENTEN
73
3.12.1.3.
DOT
BLOT
73
3.12.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-PROBEN
74
3.12.2.1.
RANDOM
PRIMING
74
3.12.2.2.
PCR-MARKIERUNG
75
3.12.2.3.
REINIGUNG
DER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDEN
UEBER
GELFILTRATION
75
3.12.3.
HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN
76
3.12.4.
REGENERATION
DER
FILTER
76
3.13.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
77
3.13.1.
ISOLIERUNG
VON
PROTEINEN
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
77
3.13.1.1.
HERSTELLUNG
EINES
GESAMTPROTEINEXTRAKTS
MIT
SDS
77
3.13.1.2.
SOLUBILISIERUNG
VON
MEMBRANPROTEINEN
MITTELS
NICHTIONISCHEM
DETERGENS
77
3.13.2.
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
78
3.13.3.
ANALYSE
VON
PROTEINEN
DURCH
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
78
3.13.4.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
DURCH
WESTERN
BLOT
82
3.13.4.1.
ELEKTROBLOT
VON
PROTEINEN
AUF
NITROCELLULOSE
82
3.13.4.2.
NICHTRADIOAKTIVER
NACHWEIS
VON
IMMOBILISIERTEN
PROTEINEN
83
3.14.
PROKARYONTE
EXPRESSION
REKOMBINANTER
POLYPEPTIDE
IM
PET-
SYSTEM
86
3.15.
ANALYSE
VON
DNA-PROTEIN-INTERAKTIONEN
88
3.15.1.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
DOPPELSTRAENGIGEN
OLIGONUKLEOTIDE
88
3.15.2.
SOUTH
WESTERN
HYBRIDISIERUNG
89
3.15.3.
BAND
SHIFT
ANALYSE
91
3.16.
EXPRESSION
MONIERTER
GENE
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
NACH
GENTRANSFER
94
3.16.1.
ETABLIERUNG
STABILER
TRANSFEKTANTEN-LINIEN
94
3.16.2.
TRANSIENTE
UEBEREXPRESSION
VON
PROTEINEN
IN
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
95
3.17.
ANALYSE
EUKARYONTISCHER
TRANSKRIPTIONSREGULATIONSELEMENTE
IM
CAT-REPORTERSYSTEM
96
3.17.1.
TRANSFEKTION
DER
ZELLEN
DURCH
ELEKTROPORATION
96
3.17.2.
PRAEPARATION
DER
ZELLEXTRAKTE
97
3.17.3.
ENZYMREAKTION
98
3.17.4.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNG
VON
SUBSTRAT
UND
PRODUKTEN
98
3.17.5.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
UND
NORMALISIERUNG
DER
KONVERSIONSRATEN
99
4.
ERGEBNISSE
100
4.1.
UNTERSUCHUNG
DER
EINZELNEN
BIOSYNTHESESTADIEN
DER
LYMPHOCYTEN-SPEZIFISCHEN
PROTEIN-TYROSIN-KINASE
ICK
IN
COLON
CARCINOMZELLEN
100
4.1.1.
DER
MENSCHLICHE
CDNA-KLON
YT16
IST
EIN
MORPHOLOGISCH
TRANSFORMIERENDES
ONCOGEN
100
4.1.1.1.
EXPRESSIONSVEKTOREN
100
4.1.1.2.
TRANSFEKTION
VON
NIH3T3
101
4.1.1.3.
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
DER
/CK-EXPRESSION
101
4.1.1.4.
WESTERN
BLOT
ANALYSE
DER
/CK-EXPRESSION
102
4.1.1.5.
MORPHOLOGISCHE
TRANSFORMATION
VON
NIH3T3-ZELLEN
103
4.1.2.
EXPRESSION
VON
IMMUNREAKTIVEN
P56
/C
*-POLYPEPTIDKETTEN
IN
METASTASIERENDEN
COLON
CARCINOMZELLEN
105
4.1.2.1.
ANALYSE
DER
CODIERENDEN
REGION
DES
FCK-GENS
AUF
MUTATIONEN
IM
C-TERMINALEN
BEREICH
106
4.1.3.
ANALYSE
DER
VERTEILUNG
VON
TYP
I
UND
TYP
IL-TRANSKRIPTEN
IM
STEADY
STATE
POOL
AN
/CK-SPEZIFISCHEN
MRNA-MOLEKUELEN
IN
DEN
COLON
CARCINOMZELLEN
108
4.1.3.1.
IDENTIFIZIERUNG
ALTERNATIV
GESPLEISSTER/CK-TYP
I
TRANSKRIPTVARIANTEN
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
5
'
UTR'S
110
4.1.4.
UNTERSUCHUNG
DES
/CK-GENS
IN
DEN
COLON
CARCINOMLINIEN
AUF
GENOMISCHER
EBENE
112
4.1.4.1.
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
HYBRIDISIERUNGSSONDEN
113
4.1.4.2.
HYBRIDISIERUNG
113
4.1.5.
SPEZIFISCHE
AKTIVIERUNG
DER
BEIDEN
/CK-PROMOTOREN
IN
DEN
COLON
CARCINOMLINIEN
UND
DEFINITION
EINES
FUER
DIE
/CK-AKTIVIERUNG
IN
DIESEN
ZELLEN
AUSREICHENDEN
ICK
TYP
I-PROMOTORFRAGMENTS
116
4.1.5.1.
KONSTRUKTION
DER
CAT-REPORTERKONSTRUKTE
116
4.1.5.2.
QUALITATIVE
CAT-ANALYSE
117
4.2.
MOLEKULARE
ANALYSE DER
EXPRESSION
VON
LYMPHOIDEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
ALS
MANIFESTATION
EINES
LYMPHOCYTEN-
SPEZIFISCHEN
DIFFERENZIERUNGSPROGRAMMS
IN
METASTASIERENDEN
COLON
CARCINOMZELLEN
121
4.2.1.
IDENTIFIZIERUNG
EINER
KONSENSUSSEQUENZ
FUER
DIE
BINDUNG
VON
HMG
BOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
IM
PROXIMALEN
BEREICH
DES
TEKTYP
I
PROMOTORS
121
4.2.1.1.
SEQUENZANALYSE
DES
PROXIMALEN
BEREICHS
DER
ENDOGENEN
ICK
TYP
I-PROMOTOREN
IN
DEN
COLON
CARCINOMLINIEN
122
4.2.2.
TCF-1
ALS
POTENTIELLER
AKTIVATOR
DER
TEK-EXPRESSION
IN
COLON
CARCINOMEN
124
4.2.2.1
.
EXPRESSIONSANALYSE
DER
LYMPHOIDEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
TCF-1,
HLEF,
UND
SOX-4
IN
DEN
COLON
CARCINOMLINIEN
AUF
TRANSKRIPTEBENE
124
4.2.2.2.
UNTERSUCHUNG
DES
TCF-1-GENLOCUS
AUF
REARRANGIERUNGEN
126
4.2.2.3.
AKTIVIERUNG
DES
TCF-1-PROMOTORS
IN
COLON
CARCINOMZELLEN
128
4.2.2.4.
ANALYSE
DER
TCF-1-EXPRESSION
IN
DEN
COLON
CARCINOMZELLEN
AUF
PROTEINEBENE
130
4.2.2.5.
IDENTIFIZIERUNG
ALTERNATIV
GESPLEISSTER
TCF-1-TRANSKRIPTE
DURCH
RT-PCR
132
4.2.3.
EXPRESSIONSANALYSE
WEITERER,
DURCH
HMG-BOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
REGULIERTER
LYMPHOIDER
GENE,
IN
COLON
CARCINOMEN
144
4.3.
BINDUNG
DER
HMG-BOX-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
TCF-1
UND
SOX-4
AN
DIE
IM
PROXIMALEN
ICK
PROMOTOR
VORHANDENE
KONSENSUSSEQUENZ
146
4.3.1.
BINDUNG
DER
PROKARYONTISCH
EXPRIMIERTEN
HMG-BOX-DOMAENEN
AN
DIE
AACAAAG-KONSENSUSSEQUENZ
IM
PROXIMALEN
ICK
PROMOTOR
146
4.3.1.1.
SOUTH-WESTEM-HYBRIDISIERUNG
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
HMG-BOX-POLYPEPTIDE
MIT
DEM
ICK
TYP
I-PROMOTOR
SPEZIFISCHEN
OLIGONUKLEOTID
147
4.3.1.2.
BAND
SHIFT
ANALYSE
DER
BINDUNG
HETEROLOG
EXPRIMIERTER
HMG
BOX-POLYPEPTIDE
AN
DAS
ICK
TYP
L-PROMOTOR-SPEZIFISCHE
OLIGONUKLEOTID
148
4.3.2.
ANALYSE
DES
EINFLUSSES
DER
AACAAAG-KONSENSUSSEQUENZ
AUF
DIE
AKTIVIERUNG
DES
PROXIMALEN
ICK
PROMOTORS
NACH
BASENSPEZIFISCHER
MUTATION
DURCH
VERGLEICHENDE
CAT-ANALYSEN
150
4.3.2.1.
ORTSSPEZIFISCHE
MUTAGENESE
DER
TCF/
SOX
KONSENSUSSEQUENZ
IM
PROXIMALEN
ICK
PROMOTOR
151
4.3.2.2.
UNTERSUCHUNG
DER
TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
VON
PCAT-E.
LCK3
'
P.MS
UND
PCAT-E.
LCK3
'
P.SAC
DURCH
VERGLEICHENDE
CAT-ANALYSEN
153
5.
DISKUSSION
161
5.1.
TRANSKRIPTIONALE
AKTIVIERUNG
DES
ICK
PROTO-ONCOGENS
IN
COLORECTALEN
TUMORZELLINIEN
UND
UEBEREXPRESSION
EINES
POTENTIELL
TRANSFORMIERENDEN
P56
/C
*-PROTEINS
161
5.2.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
PROXIMALEN
BEREICHS
DES
ICK
TYP
I-PROMOTORS
165
5.3.
TCF-1
ALS
EIN
POTENTIELLER
AKTIVATOR
DES
PROXIMALEN
ICK
PROMOTORS
INNERHALB
EINES
LYMPHOCYTEN-SPEZIFISCHEN
DIFFERENZIERUNGSPROGRAMMS
IN
COLON
CARCINOMZELLEN
173
5.3.1.
AKTIVIERUNG
DER
EKTOPEN
TCF-1-EXPRESSION
IN
DEN
COLON
CARCINOMLINIEN
AUF
PROMOTOREBENE
UND
SYNTHESE
VON
MULTIPLEN
TCF
1
-ISOFORMEN
INFOLGE
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
176
5.3.2.
BEDEUTUNG
DER
AACAAAG-TCF/SOX-KONSENSUSSEQUENZ
IM
PROXIMALEN
ICK
PROMOTOR
FUER
DESSEN
AKTIVIERUNG
IN
COLON
CARCINOMZELLEN
181
5.4.
UEBERLEGUNGEN
ZUR
ENTSTEHUNG
UND
FUNKTION
ALTERNATIV
GESPLEISSTER
ICK
UND
TCF-1-ISOFORMEN
187
5.4.1.
MECHANISMEN
UND
MOEGLICHKEITEN
DER
REGULATION
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
187
5.4.2.
KONSEQUENZEN
DES
ALTERNATIVEN
SPLEISSENS
192
6.
ZUSAMMENFASSUNG
195
7.
LITERATURVERZEICHNIS
197
8.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
216
9.
ANHANG
219 |
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