Kartierung von RNA-Liganden im elongierenden 70S-Ribosom durch Protonenspin-Kontrastvariation: Lokalisation der mRNA
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
0.
ABKUERZUNGEN
.
1
1.
EINLEITUNG
.
4
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
11
2.1.
MATERIALIEN
UND
BEZUGSQUELLEN
.
11
2.2.
PUFFER,
GELLOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
14
23.
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
.
21
2.4.
ANALYTISCHE
METHODEN
.
24
2.4.1.
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
.
24
2.4.1.1.
PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUCLEINSAEUREN
.
24
2.4
1.2.
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNGEN
RIBOSOMALER
PROTEINE
.25
2.4.2.
RADIOAKTIVITAETSMESSUNG
.
25
2.4.3.
ANALYTISCHE
SUCROSE-GRADIENTEN-ZENTRIFUGATION
.
26
2.4.4.
GEL-ELEKTROPHORESEN
.
26
2.4.4.1.
HARNSTOFF-POLYACRYLAMID-FLAECHENGELELEKTROPHORESE
.
26
2.4
4.2.
ZWEIDIMENSIONALE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
27
2.4.4.3.
RNA-SDS-POLYACRYLAMID-STABGELELEKTROPHORESE
.
28
2.4.4.4
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
29
2.5.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
29
2.5.1.
STAMMHALTUNG
(KONSERVIERUNG)
.
29
2.5.2.
AUFZUCHT
VON
E.
COLI
STAEMMEN
.
30
2.5.3.
AUFNAHME
VON
WACHSTUMSKURVEN
.
30
2.5.4.
SPOTTEST
.
30
2.5.5.
RNASE-TEST
.
31
2.5.6.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
(ELEKTROPORATION)
.
31
2.5.7.
BLAU/WEISS-SELEKTION
TRANSFORMIERTER
E.
COLI-ZELLEN
.
32
2.5.8.
ADAPTATION
VON
ZELLEN
AN
DEUTERIERTES
MINIMALMEDIUM
.
33
2.5.9.
FERMENTATION
.
33
2.5
9.1.
FERMENTATION
MIT
PROTONIERTEM
VOLLMEDIUM
.33
2.5.9.2.
KONTINUIERLICHE
FLUSS-FERMENTATION
MIT
DEUTERIERTEM
MINIMALMEDIUM
.
33
2.6.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
(DNA)
.
34
2.6.1.
EXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
DNA
.
34
2.6.1.1.
EXTRAKTION
VON
DNA
MIT
PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL
.
34
2.6.1.2.
ETHANOL-FAELLUNG
VON
DNA
.34
2.6.2.
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
E.
COLI
DNA
.
35
2.6.3.
PLASMIDISOLIERUNG
.
35
2.6.3.1
PLASMIDPRAEPARATION
IM
KLEINEN
MASSSTAB
(YYMINI-PRAEP.
"
)
.
35
2.6.3.2.
PLASMIDISOLIERUNG
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
.
36
2.6.4.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
PLASMIDEN
.
37
2.6.5.
AUFREINIGUNG
VON
DNA
UEBER
EIN
PRAEPARATIVES
AGAROSE-GEL
.
37
2.6.6.
5
'-DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
37
2.6.7.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
38
2.6.8.
CHEMISCHE
SYNTHESE
UND
AUFREINIGUNG
VON
DESOXY-OLIGONUCLEOTIDEN
.
38
2.6.9.
PCR-AMPLIFIKATION
VON
DNA
.
39
2.7.
PRAEPARATION
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
KOMPONENTEN
DES
TRANSLATIONSAPPARATES
.
40
2.7.1.
DARSTELLUNG
RIBOSOMALER
PARTIKEL
.
40
2.7.1.1.
ZELLAUFSCHLUSS
UND
ISOLIERUNG
RIBOSOMALER
PARTIKEL
.
40
2.7.1
2.
ZONALZENTRIFUGATION
ZUR
ISOLIERUNG
VON
70S
RIBOSOMEN
.
40
2.7.1.3.
ZONALZENTRIFUGATION
ZUR
TRENNUNG
DER
UNTEREINHEITEN
.
42
2.7.2.
GEWINNUNG
HETEROPOLYMERER
MRNA
.
42
2.7.2.I.
PLASMIDVORBEREITUNG
.
43
2.7.2
2.
T7
IN
VITRO
TRANSCRIPTION
.
44
2.7.2.3.
GELREINIGUNG
DES
TRANSCRIPTIONSPRODUKTES
.
45
2.7.2.4.5'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
MRNA
.
46
2.7.3.
PRAEPARATION
SPEZIFISCHER
TRNAS
.
46
2.7.3.1
ANALYTISCHE
TRNA
BULK
PRAPARATION
.
47
2.7.3.2.
PRAEPARATIVE
GEWINNNUNG
VON
TRNA
BU,K
.47
2.7.3.3
REINIGUNG
SPEZIFISCHER
DEACYLIERTER
TRNAS
.
48
2.7.3.3.
1.
FRAKTIONIERUNG
DURCH
ANIONENAUSTAUSCHER-CHROMATOGRAPHIE
.
48
2.7.3
3.2.
UMKEHRPHASEN-HPLC
.
48
2.7.3.3.3.
5
'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
DEACYL-TRNAS
.
49
2.7.3.4.
BELADUNG
UND
MODIFIZIERUNG
VON
TRNAS
.
49
2.7.3
4.1.
ANALYTISCHER
LIGASETEST
.
49
2.7.3.4.2.
AMINOACYLIERUNG
UND
N-ACETYLIERUNG
VON
TRNA
"
"
.
50
2.7.3.4.3.
AMINOACYLIERUNG
UND
FORMYLIERUNG
VON
TRNAF
1
*
1
.
50
2.7.3.4.4.
DEACYLIERUNG
BELADENER
TRNAS
.
51
2.7.3.5.
HPLC-AUFREMIGUNG
BELADENER
TRNAS
.
52
2.7.4.
IN
VUERO-FUNKTIONS-SYSTEME
.
53
2.7.4.1.
POLY(U)-ABHANGIGE
POLY(PHE)-SYNTHESE
.53
2.7.4.2.
STELLENSPEZIFISCHE
TRNA-BINDUNG
AN
70S
.
53
2.7.4.3.
AC-PHE-TRNA
PLK
-SAETTIGUNGSREIHE
.
56
2.8.
STRUKTURUNTERSUCHUNG
DURCH
NEUTRONENSTREUUNG
.
57
2.8.1.
PROBENPRAEPARATION:
DARSTELLUNG
RIBOSOMALER
ELONGATIONSZUSTAENDE
.
57
2.8.1.1.
STELLENSPEZIFISCHE TRNA-BINDUNG AN
70S
.57
2.8.1.2.
ABTRENNUNG
NICHT
GEBUNDENER
LIGANDEN
.58
2.8.1
3.
PROBENVORBEREITUNG
.59
2.8.1.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
FINALEN
ELONGATIONSKOMPLEXE
.
60
2.8.2.
NEUTRONENSTREUANALYSE
.
.61
2.8.2.1.
AUFBAU
DES MESSPLATZES
SANS
!
.
61
2.8.2.2.
DATENAUFNAHME
.
61
2.8.2.3.
DATENPROZESSIERUNG
.62
2.8.2.3.1.
REDUKTION
UND
KORREKTUR
DER
DATEN
.
62
2
8.2
3.2.
ERMITTLUNG
DER
GRUNDSTREUFUNKTIONEN
.62
2.8.2.3.3.
MODELLANPASSUNG
AN
DIE
GRUNDSTREUFUNKTIONEN
.63
3.
ERGEBNISSE
.67
3.1.
ISOLIERUNG
VON
70S
RIBOSOMEN.
.
67
3.1.1.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DEUTERIERTER
70S
RIBOSOMEN
.
67
3.1.2.
VERSUCHE
ZUR
EINFUEHRUNG
EINES
PROTEINMARKERS
.
71
3.1.2.1.
AUSWAHL
EINES
GEEIGNETEN
PROTEINS
.
72
3.1.2.2.
LL-KLONIERUNG
UND
INSERTIONSDESAKTIVIERUNG
.
73
3.1.2.3.
VERSUCHE
ZUR
SUBSTITUTIONSDELETION
DES
CHROMOSOMALEN
RP/A-GENS
IN
MREOEOORIF
.
80
3.1.2.3.1.
TRANSFORMATION
MIT
PBS-LLRTC'
.
80
3.1
2.3.2.
TRANSFORMATION
MIT
LINEAREM
FRAGMENT
LL::TC
R
.
81
3.1.2.3.3.
VERWENDUNG
VON
PLASMIDEN
MIT
TEMPERATURSENSITIVER
REPLIKATION
.
84
3.I.2.4.
ADAPTATION
VON
MV17-10
AN
DEUTERIERTES
MINIMALMEDIUM
.
89
3.2.
DARSTELLUNG
VON
MF-MRNA
.
90
3.2.1.
VORBEREITUNG
DES
PLASMIDES
PTMF
.
90
3.2.2.
IN
VITRO
TRANSCRIPTION
UND
PRODUKTREINIGUNG
.
92
3.2.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEWONNENEN
MF-MRNA
.
92
3.2.4.
VERGLEICH
VON
PROTONIERTER
UND
DEUTERIERTER
MF-MRNA
.
94
3.3.
UEBERPRODUKTION
SPEZIFISCHER
TRNAS
IN
VIVO
.
96
3.3.1.
CHARAKTERISIERUNG
VON
TRNA
UEBEREXPRIMIERENDEN
PLASMIDEN
.
96
3.3.2.
KONSTRUKTION
EINES
PLASMIDES
FUER
DIE
UEBERPRODUKTION
VON
TRNA
PLIE
UND
TRNA
"
EL
.
98
3.3.3.
STAMMVERGLEICH
:
UEBERPRODUKTION
IN
HB
101
UND
MREOEOORIF
.
104
3.3.4.
MEDIENVERGLEICH
:
UEBERPRODUKTION
IN
LB-MEDIUM
UND
MINIMALMEDIUM
.
106
3.3.5.
WACHSTUMS
VERHALTEN
VON
TRNA-UEBERPRODUZIERENDEN
MREOEOORIF-STAEMMEN
.108
3.3.6.
ISOTOPENVERGLEICH
:
UEBERPRODUKTION
IN
PROTONIERTEM
UND
DEUTERIERTEM
MEDIUM
.
109
3.3.7.
WACHSTUM
UND
TRNA-UEBERPRODUKTION
UNTER
FERMENTATIONSBEDINGUNGEN
.
109
3.4.
GEWINNUNG
VON
SPEZIFISCHEN
DEUTERIERTEN
TRNAS
.
112
3.4.1.
ISOLIERUNG
UND
AUFTRENNUNG
VON
D
TRNA
BULK
.
112
3.4.2.
HPLC-REINIGUNG
VON
D
TRNA
PBE
UND
AC-[
L4
C]PHE
D
TRNA
PHE
.
116
3.4.3.
HPLC-REINIGUNG
VON
D
TRNA
MET
UND
F-[
14
C]MET
D
TRNA
M
"
.
119
3.4.4.
WIEDERGEWINNUNG
DEUTERIERTER
TRNAS
NACH
DARSTELLUNG
VON
ELONGARIONSKOMPLEXEN
.
122
3.5.
HERSTELLUNG
RIBOSOMALER
ELONGATIONSKOMPLEXE
.
124
3.5.1.
EINGESETZTE
KOMPONENTEN
UND
ANALYSEN
.
124
3.5.2.
DARSTELLUNG
VON
ELONGATIONSKOMPLEXEN
MIT
MARKIERTER
MRNA
.
126
3.6.
NEUTRONENSTREUANALYSE
UND
DATENPROZESSIERUNG
:
LOKALISATION
DER
MRNA
.131
3.6.1.
OPTIMIERUNG
DER
70S-KONTRASTPARAMETER
.
134
3.6.2.
FORMPARAMETER
DER
MRNA
.
136
3.6.3.
LOKALISIERUNG
DER
MRNA
IM
RIBOSOM
.
137
4.
DISKUSSION
.
150
4.1.
UEBEREXPRESSION
VON
DEUTERIERTEN
TRNAS
.
150
4.2.
KARTIERUNG
VON
RNA-LIGANDEN
IM
ELONGIERENDEN
70S
RIBOSOM
MIT
NEUTRONENSTREUUNG
.
153
4.2.1.
BEDEUTUNG
UND
GRUNDLAGEN
DER
PROTONENSPIN-KONTRASTVARIATION
.
153
4.2.2.
ZUR
LOKALISIERUNG
DER
MRNA
.
158
4.2.2.1.
FORMPARAMETER
DER
MRNA
.
159
4.2.2
2.
POSITIONIERUNG
DER
MRNA
.
160
4.2.3.
SCHRITTE
ZU
EINEM
STRUKTURELLEN
70S
FUNKTIONSMODELL
.
165
4.2.4.
VERSUCHE
ZUR
EINFUEHRUNG
EINES
PROTEINMARKERS
IN
70S
RIBOSOMEN
.
169
5.
LITERATUR
.
173
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
187
ANHANG
.
I
I.
LEBENSLAUF
.
I
II.
EIGENE
VEROEFFENTLICHUNGEN
.
II
III.
INTERNATIONALE
VORTRAEGE
1994/95
.
III
IV.
DANK
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