Produktion und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen die stomatäre Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Vicia faba L.:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
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1995
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| Beschreibung: | Bonn, Univ., Diss., 1995 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG.1
2 MATERIAL UND METHODEN.11
2.1 PFLANZENMATERIAL UND -ANZUCHT.11
2.1.1 ISOLIERUNG DER EPIDERMEN.11
2.1.1.1 GEWINNUNG DER EPIDERMEN DURCH "STRIPPEN".11
2.1.1.2 GEWINNUNG DER EPIDERMEN MITTELS BLENDER.12
2.1.2 EXTRAKTION DER PEP-CARBOXYLASE.12
2.1.3 FRAKTIONIERTE AMMONIUMSULFATFAELLUNG.13
2.1.4 PRAEPARATIVE SAEULENCHROMATOGRAPHIE - GELFILTRATION.14
2.1.5 ULTRAFILTRATION.14
2.1.5.1 AMICON PM 30; PM 100.15
2.1.5.2 CENTRICON 30.15
2.1.6 LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE-DEAE-SEPHAROSE CI 6B-100.15
2.1.7 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE.17
2.1.7.1 DURCHFUEHRUNG DER DISKONTINUIERLICHEN SODIUMDODECYLSULFAT-
PAGE NACH LAEMMLI (1970).18
2.1.7.1.1 MINI-GELELEKTROPHORESE (VERTIKALE ELEKTROPHORESE).18
2.1.7.2 NATIVE ELEKTROPHORESE.21
2.1.7.3 OXALACETATNACHWEIS IM POLYACRYLAMIDGEL (PEPCASE-
AKTIVITAETSTEST).21
2.1.7.4 ELUTION DER PEPCASE AUS POLYACRYLAMIDGEL.21
2.1.7.4.1 ELUTION DER PEPCASE AUS NATIVEM POLYACRYLAMIDGEL .21
2.1.7.4.2 ELEKTROELUTION.22
2.1.7.4.2.1 PRAEPARATIVE POLYACRYLAMIDGEL ELEKTRO
PHORESE 22
2.1.7.4.2.2 PRAEPARATIVE NATIVE-POLYACRYLAMIDGEL
ELEKTROPHORESE 23
2.1.7.5 ANFAERBEN DER PROTEINBANDEN.23
2.1.7.5.1 COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250 FAERBUNG.24
2.1.7.5.2 SILBEMITRAT FAERBUNG.24
2.1.7.5.3 KONSERVIERUNG DER GELE DURCH TROCKNUNG.25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.1.7.6 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG IM GEL.25
2.1.8 WESTEM-IMMUNOBLOT NACH TOWBIN ET AL. (1979).26
2.1.8.1 ELEKTROBLOTTING VON PROTEINEN AUF NITROCELLULOSE.26
2.1.8.1.1 NASS-BLOT.26
2.1.8.1.2 SEMI-DRY-BLOT.27
2.1.8.2 PONCEAU-FAERBUNG DER NITROCELLULOSE.28
2.1.8.3 IMMUNDETEKTION.28
2.1.9 AKTIVITAETSTEST DER PEPCASE IM PHOTOMETER.32
2.1.10 PROTEINBESTIMMUNG.33
2.1.11 AUFBEREITUNG EINES TAGESGANGES.34
2.1.12 IMMUNPRAEZIPITATION.34
2.1.13 DENSITOMETRISCHE AUSWERTUNG.36
2.2 MONOKLONALE ANTIKOERPER.37
2.2.1 TIERE.37
2.2.2 IMMUNISIERUNG.37
2.2.3 BLUTENTNAHME UND GEWINNUNG DES BLUTSERUMS.38
2.2.4 MYELOMZELLEN. 39
2.2.5 VITALITAETSKONTROLLE DER ZELLEN.40
2.2.6 EINSTELLUNG DER ZELLDICHTE.40
2.2.7 MAKROPHAGEN.41
2.2.8 FUSION VON MILZZELLEN EINER HYPERIMMUNEN BALB/C MAUS MIT MYE
LOMZELLEN DERZELLINIE PAI.41
2.2.8.1 HERZPUNKTION.42
2.2.8.2 MILZPRAEPERATION (HAJEK 1990) 42
2.2.9 SELEKTION ANTI-PEPCASE SPEZIFISCHER MILZZELLEN MITTELS PANNING.43
2.2.10 MEDIEN.44
2.2.10.1 SELEKTIONSMEDIUM HAT.44
2.2.10.2 EINFRIERMEDIUM.45
2.2.11 PFLEGE DER HYBRIDOMKOLONIEN.45
2.2.12 MONOKLONIERUNG DER HYBRIDOMZELLEN.46
2.2.13 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY).47
2.2.13.1 ERMITTLUNG PEPCASE HALTIGER FRAKTIONEN AUS CHROMATOGRA
PHIE UND PRAEPATIV ELEKTROPHORESEN.51
2.2.13.2 VERLAUFEKONTROLLE DER IMMUNISIERUNG.51
2.2.13.3 SCREENING DER HYBRIDOMKULTUREN.52
2.2.13.4 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER.52
2.2.13.4.1 SUBKLASSENTEST.52
2.2.13.4.2 ERMITTLUNG VON SEQUENTIELLEN- UND KONFORMATIONS-
ANTIKOERPERN.
53
2.2.13.4.3 UEBERPRUEFUNG DER IMMUNPRAEZIPITATION.
53
2.2.13.5 BIOTINYLIERUNG VON ANTI-PEPCASE-LGG-ANTIKOERPERN.
54
2.2.13.6 EPITOPEN-TEST (ERIGUET ET AL. 1983).
55
2.2.14 AUFREINIGUNG VON ANTIKOERPERN AUS HYBRIDOMZELLUEBERSTAENDEN.56
2.2.15 IGG-ANREICHERUNG DURCH LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE.
57
2.2.16 IGG-REINIGUNG MITTELS PROTEIN A-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE.
57
3 ERGEBNISSE.58
3.1 MONOKLONALE ANTIKOERPER GEGEN DIE STOMATAERE PEPCASE AUS
VICIA FABA L.58
3.1.1 EXTRAKTION DER STOMATAEREN PEPCASE AUS EPIDERMISSTREIFEN.58
3.1.2 REINIGUNG DER STOMATAEREN PEPCASE.
59
3.
1
.
2.1
GEWINNUNG NATIVER STOMATAERER PEPCASE MITTELS PRAEPARATIVER
ELEKTROPHORESE.
66
3.1.3 IMMUNISIERUNG.72
3.1.3.1 INDUZIERUNG VON IGG-SUBKLASSEN.76
3.1.4 PANNING.
79
3.1.5 CHARAKTERISIERUNG DER ELISA-SELEKTIERTEN HYBRIDOMZELLINEN.82
3.
1.6
EPITOPANALYSE.89
3.1.7 IMMUNPRAEZIPITATION.
91
3.1.8 AUFREINIGUNG MONOKLONALER IGG AUS KULTURUEBERSTAND.93
3.
1
.
8.1
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE ZUR REINIGUNG MONO
KLONALER IGG-ANTIKOERPER AUS HYBRIDOMKULTURUEBERSTAENDEN.
93
3.1.8.2 AUFREINIGUNG MONOKLONALER IGG DURCH 50%IGE AMMONIUMSUL
FATFAELLUNG.
93
3.1.8.3 ELIMINIERUNG STOERENDER BEGLEITPROTEINE BEI DER REINIGUNG DER
MAK DURCH ULTRADRUCKFILTRATION (AMICON XM 100).94
3.1.9 BEEINFLUSSUNG DER AKTIVITAET DER PEPCASE DURCH MAK.
95
3.1.10 TAGESGANG.102
3.1.11 ERWAEHNENSWERTE BESONDERHEITEN BEI DER ARBEIT MIT DER STOMATAEREN
PEPCASE AUS
VICIA FABA L.118
4 DISKUSSION.122
4.1 REINIGUNG DER STOMATAEREN PEPCASE.123
4.2 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER GEGEN DIE STOMATAERE PEPCASE.130
4.3 CHARAKTERISIERUNG DER MAK.139
4.4 TAGESGANG.154
5 ZUSAMMENFASSUNG.164
6 LITERATUR. 169 |
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