Analyse der repetitiven Sequenzen in Zellinien des Syrischen Hamsters mittels Inter-LINE-PCR:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
|
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| Beschreibung: | München, Univ., Fak. für Biologie, Diss., 1996 |
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1
EINLEITUNG
.
5
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
18
2.1
MATERIAL
.
18
2.1.1
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
FUER
EINHEITEN
.
18
2.1.2
SHE-ZELLINIEN
.
20
2.1.3
HAEUFIG
VERWENDETE
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
23
2.1.4
NAEHRMEDIEN
.
23
2.1.4.1
MEDIUM
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
E.
COLI
.
23
2.1.4.2
MEDIUM
FUER
DIE
KULTUR
VON
SHE-ZELLEN
.
24
2.1.5
OLIGONUKLEOTIDE
(PRIMER)
.
24
2.1.5.1
VEKTOR-HOMOLOGE
PRIMER
.
24
2.1.5.2
SONSTIGE
PRIMER
.
25
2.1.6
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
25
2.1.7
FEINCHEMIKALIEN
.
26
2.1.8
ENZYME
.
26
2.1.9
GERAETE
.
27
2.1.10
COMPUTERPROGRAMME
.
27
2.1.11
SONSTIGES/VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
28
2
LNHAHSEIZ,G
I
,
CHNS
2.2
METHODEN
.
29
2.2.1
DNA-GELELEKTROPHORESE
.
29
2.2.1.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
29
2.2.1.2
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
29
2.2.2
REINIGUNG
DER
DNA
.
31
2.2.2.1
GLASMILCHBEHANDLUNG
.
31
2.2.2.2
ALKOHOLFAELLUNG
.
.-.
.
32
2.2.3
MODIFIKATION
DER
DNA
DURCH
ENZYME
.
32
2.2.3.1
RESTRIKTIONSVERDAU
.
32
2.2.3.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
DER
DNA
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.
32
2.2.3.3
VERKNUEPFUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
MIT
T^DNA-LIGASE
.
33
2.2.3.4
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-0H-ENDEN
.
33
2.2.4
ZELLKULTUR
VON
EMBRYONALZELLEN
DES
SYRISCHEN
HAMSTERS
(SHE)
.
34
2.2.5
DNA-PRAEPARATION
AUS
SHE-ZELLEN
(ZELLKULTUR)
.
35
2.2.6
KONSTRUKTION
EINER
GENOMISCHEN
DNA-BANK
IM
BAKTERIOPHAGEN-VEKTOR
.
36
2.2.6.1
LIGATION
.
36
2.2.6.2
VERPACKUNG.37
2.2.6.3
TRANSFEKTION
.
37
2.2.6.4
BAKTERIOPHAGEN-DNA-ISOLIERUNG
.
38
2.2.6.5
PRAEPARATION
DER
REKOMBINANTEN
DNA
AUS
DEN
KLONEN
.
39
2.2.6.6
WEITERE
BANKEN
.
40
2.2.7
KONSTRUKTION
REKOMBINANTER
PLASMIDE
.
40
2.2.7.1
LIGATION
.
40
2.2.7.2
KOMPETENTE
E.COLI-ZELLEN
.
41
2.2.7.3
PLASMID-TRANSTORMATION
VON
E.COLI-ZELLEN
.
41
2.2.7.4
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
(MAXI-PRAEP)
.
42
2.2.7.5
PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG
(MINI-PRAEP)
.
43
2.2.8
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
.
43
2.2.8.1
"
RANDOM-PRIME
"
.
43
3
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.8.2
ENDMARKIERUNG
.
44
2.2.8.3
PCR-MARKIERUNG
.
45
2.2.9
DIE
POLYMERASE
CHAIN
REAKTION
.
46
2.2.9.1
STANDARD-PCR
.
46
2.2.9.2
INTER-LINE-PCR
.
47
2.2.9.3
MATRIZEN-DNA
FUER
DIE
IL-PCR
.
47
2.2.10
SOUTHERN
HYBRIDISIERUNG
VON
AGAROSEGELEN
.
48
2.2.11
PLAQUE-HYBRIDISIERUNG
.
49
2.2.12
SEQUENZANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
50
2.2.12.1
ANSETZEN
DER
SEQUENZREAKTIONEN
.
52
2.2.12.2
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
53
2.2.12.3
SEQUENZAUSWERTUNG
.
54
2.2.13
VERGLEICHENDE
SEQUENZANALYSE
.
54
2.2.13.1
DATENBANKEN
.
54
2.2.13.2
HUSAR
.
55
2.2.14
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
55
2.2.14.1
PRAEPARATION
DER
METAPHASEN
.
55
2.2.14.2
MARKIERUNG
DER
PROBEN
DNA
.
56
2.2.14.3
HYBRIDISIERUNG
.
56
2.2.14.4
WASCHSCHRITTE
UND
IMMUNOFLUORESZENZDETEKTION
.
57
3.
ERGEBNISSE
.
58
3.1
DIFFERENTIELLE
HYBRIDISIERUNG
.
58
3.2
FLUORESZENZ
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
.
61
3.3
MOLEKULARE
ANALYSE
DER
ISOLIERTEN
LINES-HOMOLOGEN
KLONE
.
65
3.3.1
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
DER
KLONE
.
65
3.3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
LINE-FLANKIERENDEN
SEQUENZEN
.
69
4
INHALTSVERZEICHNIS
3.4
KONZEPT
DER
INTER-LINE
PCR
.
73
3.4.1
KONSTRUKTION
EINER
GENOMISCHEN
BAKTERIOPHAGENBANK ZUR
ISOLATION
WEITERER
LINES-HOMOLOGER
KLONE
.
76
3.4.2
LOKALISATION
DER
LINES-HOMOLOGEN
KLONE
UND
UEBERPRUEFUNG
DER
TAXONOMISCHEN
GESCHLOSSENHEIT
.
78
3.5
ENTWICKLUNG
DER
IL-PCR
.
87
3.5.1
KONSTRUKTION
DER
LINES-SPEZIFISCHEN
PCR-OLIGONUKLEOTIDE
.
87
3.5.2
OPTIMIERUNG
DER
IL-PCR
.
93
3.5.3
ELEKTROPHORESE
.
94
3.5.4
OPTIMIERUNG
DER
ANNEA/ING-TEMPERATUR
.
96
3.5.5
BESTIMMUNG
DER
IDEALEN
OLIGONUKLEOTIDKONZENTRATION
.
99
3.5.6
EINFLUSS
DER
TAQ-POLYMERASE
.
100
3.5.7
EINFLUSS
DER
MENGE
AN
EINGESETZTER
MATRIZEN-DNA
.
101
3.5.8
SONSTIGE
PARAMETER
.
102
3.6
ANALYSE
DER
SHE-ZELLINIEN
MIT
IL-PCR
.
105
3.6.1
VORVERSUCHE
ZUR
ANALYSE
DER
IL-PCR-PRODUKTE
.
106
3.6.2
SEQUENZANALYSE
EINIGER
AMPLIFIKATIONSPRODUKTE
.
108
3.6.3
DIREKTE
ANALYSE
VON
VARIIERENDEN
IL-PCR-PRODUKTEN
.
110
3.6.4
INDIREKTE
ANALYSE
DER
IL-PCR-PRODUKTE
.
119
3.7
WEITERE
ANWENDUNGSBEISPIELE
FUER
DIE
IL-PCR
.
125
4
DISKUSSION
UND
ZUSAMMENFASSUNG
.
134
5
LITERATURVERZEICHNIS
.
146
6
ANHANG
.
163 |
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