Molekularbiologische, immunologische und elektrophysiologische Charakterisierung von Untereinheiten der zyklisch nukleotidgesteuerten Ionenkanäle aus der Netzhaut und dem Riechepithel von Wirbeltieren:
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
1996
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3178 |
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I
INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
I
D
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1
EINLEITUNG
1
1.1
FUNKTION
UND
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER
CNG-KANAELE
IN
PHOTOREZEPTOR
-ZELLEN
UND
SENSORISCHEN
NEURONEN
DES
RIECHEPITHELS
VON
WIRBELTIEREN
1
1.2
STRUKTURMERKMALE
UND
CHARAKTERISTISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
CNG-KANAELEN
5
1.3
CHARAKTERISTISCHE
UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
DEN
NATIVEN
UND
DEN
KLONIERTEN
CNG-KANAELEN
7
1.4
ZIELSETZUNG
9
2
MATERIAL
UND
METHODEN
10
2.1
MATERIAL
10
2.2
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDVEKTOREN
UND
CDNA-BIBLIOTHEKEN
10
2.2.1
E.COLI
K12-BAKTERIENSTAEMME
10
2.2.2
PLASMIDVEKTOREN
11
2.2.3
CDNA-BIBLIOTHEKEN
11
2.3
GROESSENSTANDARDS
12
2.4
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
12
2.5
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
UND
PROTEINEN
13
2.5.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
13
2.5.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
13
2.6
ANZUCHT
VON
E.COLI
K12-BAKTERIENKULTUREN
13
2.6.1
HERSTELLUNG
VON
"MG
2+
-ZELLEN"
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
X-PHAGEN
DNA
14
2.6.2
ANZUCHT
VON
E.COZZ-ZELLEN
ZUR
EXPRESSION
VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
(GST)
UND
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
14
2.6.3
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
ZELLEN
ZUR
TRANSFORMATION
MIT
PLASMID-DNA
14
2.7
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
14
2.7.1
ALKALISCHE
MINI-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
14
2.7.2
MIDI-,
MAXI-UND
MEGA-PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
15
2.7.3
PRAEPARATION
VON
MRNA
AUS
GEWEBEN
15
2.8
MODIFIZIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
15
2.8.1
GLAETTEN
UEBERHAENGENDER
ENDEN
15
2.8.2
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5'-DNA-ENDEN
15
2.8.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
GESCHNITTENER
DNA-VEKTOREN
15
2.9
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
16
2.9.1
RESTRIKTION
VON
DNA
16
2.9.2
DNA-SEQUENZIERUNG
16
2.9.3
GELELEKTROPHORESE
16
2.9.3.1
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
16
2.9.3.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
16
2.9.3.3
AUFTRENNUNG
VON
MRNA
17
2.9.3.4
AUFTRENNUNG
VON
SEQUENZIERREAKTIONEN
17
2.10
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
17
2.10.1
LIGATION
17
2.10.2
TRANSFORMATION
18
2.11
ISOLIERUNG
VON
SPEZIFISCHEN
KLONEN
AUS
CDNA-BIBILIOTHEKEN
18
2.11.1
AUSPLATTIEREN
VON
REKOMBINANTEN
X-PHAGEN
18
2.11.2
ISOLIERUNG
VON
X-PHAGEN
18
2.12
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEUREN
19
2.12.1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
SPEZIFISCHER
SONDEN
19
2.12.2
TRANSFER
UND
IMMOBILISIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
NYLONMEMBRANEN
19
2.12.2.1
TRANSFER
UND
IMMOBILISIERUNG
VON
X-PHAGEN
DNA
19
2.12.2.2
TRANSFER
VON
RNA
(NORTHEMBLOT)
19
2.12.3
HYBRIDISIERUNG
20
2.13
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
20
2.14
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
21
2.15
SYNTHESE
VON
EINZELSTRAENGIGER
CDNA
22
2.16
GELELEKTROPHORESE,
TRANSFER
UND
IMMOBILISIERUNG
VON
PROTEINEN
22
2.17
HERSTELLUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
22
2.17.1
EXPRESSION
VON
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
(GST)
UND
VON
GST
FUSIONSPROTEINEN
22
2.17.2
REINIGUNG
VON
GST
UND
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
23
2.17.3
KOPPLUNG
VON
PEPTIDEN
AN
TRAEGERPROTEINE
23
2.17.4
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
24
2.17.5
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
24
2.18
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
IMMOBILISIERTEN
PROTEINEN
25
2.19
HETEROLOGE
GENEXPRESSION
IN
HEK
293-ZELLEN
26
2.19.1
KULTURBEDINGUNGEN
FUER
HEK
293-ZELLEN
26
2.19.2
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
HEK
293-ZELLEN
27
2.20
ZELL
UND
GEWEBEPRAEPARATIONEN
28
2.20.1
PRAEPARATION
VON
HEK
293-ZELLEN
28
2.20.2
PRAEPARATION
VON
FROSCHRIECHEPITHELIEN
UND
VON
RINDEMETZHAEUTEN
28
2.21
IMMUNHISTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
PROTEINEN
29
II
2.22
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
VON
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN,
ZYKLISCH
NUKLEOTID-GESTEUERTEN
LONENKANAELEN
29
2.22.1
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
XENOPUS
ZAEVW-OOZYTEN
30
2.22.2
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
HEK
293-ZELLEN
30
2.23
NACHWEIS
DES
CGMP-INDUZIERBAREN
CA
2+
-EINSTROMS
DURCH
CNG-KANAELE
31
3
ERGEBNISSE
33
3.1
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
SS-UNTEREINHEIT
DES
CGMP-KANALS
AUS
RINDERSEHSTAEBCHEN
33
3.1.1
KLONIERUNG
UND
SEQUENZMERKMALE
DER
SS-UNTEREINHEIT
DES
CGMP-KANALS
AUS
DER
RINDEMETZHAUT
33
3.1.2
KONSTRUKTION
DES
GESAMTKLONS
PBRSS
AUS
DEN
TEILKLONEN
38
3.1.3
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
RSS
IN
DER
RINDEMETZHAUT
39
3.1.4
MODIFIZIERUNG
VON
PBRSS
FUER
DIE
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
HEK
293-ZELLEN
40
3.1.5
WESTEMBLOT-ANALYSEN
ZUM
VERGLEICH
VON
RSS
MIT
DEM
240K-PROTEIN
42
3.1.6
IMMUNHISTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
VON
RSS
IN
SEHSTAEBCHEN
DER
RINDEMETZHAUT
44
3.1.7
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
DES
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
CGMP
KANALS
AUS
SEHSTAEBCHEN
DER
RINDEMETZHAUT
45
3.1.8
KLONIERUNG
EINES
WEITEREN
GARP-KLONS
48
3.1.9
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
GARPAGLU
IN
DER
RINDEMETZHAUT
51
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZYKLISCH
NUKLEOTID-GESTEUERTEN
LONENKANAELE
DES
FROSCHRIECHEPITHELS
53
3.2.1
KLONIERUNG
VON
ZWEI
A-UNTEREINHEITEN
DER
CAMP-KANAELE
AUS
DEM
RIECHEPITHEL
DES
FROSCHES
53
3.2.2
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
ZUR
KLONIERUNG
WEITERER
UNTEREINHEITEN
DER
CAMP-KANAELE
AUS
DEM
FROSCHRIECHEPITHEL
55
3.2.2.1
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
ZUR
KLONIERUNG
VON
WEITEREN
FA-UNTEREINHEITEN
55
3.2.2.2
KLONIERUNG
EINER
SS-UNTEREINHEIT
DER
CAMP-KANAELE
AUS
DEM
FROSCHRIECHEPITHEL
56
3.2.3
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
VON
FAL,
FA2
UND
FSS
IM
FROSCHRIECHEPITHEL
59
3.2.4
IMMUNHISTOCHEMISCHE
LOKALISIERUNG
DER
FA-UNTEREINHEITEN
IM
RIECHEPITHEL
DES
FROSCHES
60
3.2.5
MODIFIZIERUNG
VON
PBFAL,
PBFA2
UND
PBFSS
FUER
DIE
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
XENOPUS
ZAEVZS-OOZYTEN
UND
HEK
293-ZELLEN
61
3.2.6
WESTEMBLOT-ANALYSE
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
FAL
UND
FA2-UNTEREINHEITEN
65
3.2.7
NACHWEIS
DER
FUNKTIONELLEN
EXPRESSION
VON
FAL,
FA2
UND
FSS
IN
HEK
293-ZELLEN
DURCH
CA
2+
-IMAGING
66
IN
67
3.2.8
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
DER
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
CAMP-KANAELE
AUS
DEM
FROSCHRIECHEPITHEL
4
DISKUSSION
69
4.1
DIE
SS-UNTEREINHEIT
DES
CGMP-KANALS
AUS
DEN
SEHSTAEBCHEN
69
4.1.1
DIE
SS-UNTEREINHEIT
DES
CGMP-KANALS
AUS
RINDERSEHSTAEBCHEN
-
EIN
POLYPEPTID
MIT
ZWEI
GAENZLICH
VERSCHIEDENEN
PROTEINANTEILEN
-
69
4.1.2
RSS
UND
DAS
240K-PROTEIN
SIND
IDENTISCH
70
4.1.3
RSS
VERLEIHT
DEN
A-UNTEREINHEITEN
DES
CGMP-KANALS
NATIVE
EIGENSCHAFTEN
UND
IST
INTEGRALER
BESTANDTEIL
DES
KANALKOMPLEXES
72
4.2
DIE
UNTEREINHEITEN
DER
CAMP-KANAELE
AUS
DEM
FROSCHRIECHEPITHEL
75
4.2.1
IM
FROSCHRIECHEPITHEL
WERDEN
ZWEI
A-UNTEREINHEITEN
UND
EINE
SS-UNTEREINHEIT
DER
CAMP-KANAELE
EXPRIMIERT
76
4.2.2
WELCHE
FUNKTIONEN,
PHYSIOLOGISCHEN
AUFGABEN
UND
STOECHIOMETRIE
HABEN
DIE
DREI
UNTEREINHEITEN
DER
CAMP-KANAELE?
76
5
ZUSAMMENFASSUNG
79
6
LITERATURVERZEICHNIS
80
7
ANHANG
88
7.1
HYBRIDISIERUNGSBEREICHE
DER
SEQUENZIER
UND
PCR-PRIMER
IN
PBRSS,
PBGARPAGLU,
PBFAL
,
PBFA2
UND
PBFSS
88
7.1.1
PBRSS
88
7.1.2
PBGARPAGLU
90
7.1.3
PBFAL
91
7.1.4
PBFA2
92
7.1.5
PBFSS
93
7.2
VERGLEICH
DER
NUKLEINSAEURESEQUENZEN
VON
PBFAL
UND
PBFA2
95
7.3
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
SS-UNTEREINHEITEN
AUS
MENSCHLICHER
NETZHAUT,
AUS
RINDERSEHSTAEBCHEN
UND
FROSCHRIECHEPITHEL
98
IV |
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