Zytokin-induzierte Expression des Rezeptors für den Makrophagen Kolonie-Stimulierenden Faktor (M-CSF) in murinen Zellinien:
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
2.
LITERATURUEBERSICHT
2
2.1
ZYTOKINE
2
2.2
ZYTOKINREZEPTOREN
5
2.2.1
EXPRESSION
DER
ZYTOKINREZEPTOREN
5
2.2.2
STRUKTUR
DER
ZYTOKINREZEPTOREN
6
2.2.3
M-CSF
REZEPTOR
11
2.3
SIGNALTRANSDUKTION
12
3.
MATERIALIEN
18
3.1.
BIOLOGISCHE
MATERIALIEN
18
3.1.1.
NAEHRMEDIEN
UND
LOESUNGEN
FUER
DIE
GEWEBEKULTUR
18
3.1.2.
NAEHRMEDIEN
UND
AGARPLATTEN
FUER
BAKTERIENKULTUREN
21
3.2.
CHEMISDIE
MATERIALIEN
22
3.2.1.
CHEMIKALIEN
22
3.2.2
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
24
3.2.3
NUKLEOTIDE
24
3.2.4.
ENZYME
25
3.2.5.
DESOXYRIBONUKLEINSAEUREN
25
3.2.6.
PLASMIDE
26
3.3.
GROESSENMARKER
FUER
GELE
27
3.3.1.
LAENGENMARKER
FUER
DNA-GELE
27
3.3.3.
MPLEKULARGEWICHTSMARKER
FUER
PROTEIN-GELE
28
3.4.
ZELLINIEN
28
3.5.
ANTIKOERPER
29
3.6.
BAKTERIEN
STAEMME
30
3.7.
GERAETE
30
3.8.
SONSTIGE
MATERIALIEN
31
4.
METHODEN
32
4.1
ARBEITEN
MIT
ZELLKULTUREN
32
4.1.1
ARBEITEN
MIT
HAEMATOPOETISCHEN
SCHWIMMZELLEN
32
4.1.1.1
KULTIVIERUNG
UND
PASSAGIEREN
VON
FDC-PMIX
GMV#2
ZELLEN
32
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.1.2
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
FDC-PMIX
GMV#2
ZELLEN
32
4.1.1.3
STIMULATION
VON
FDC-PMIX
GMV#2
ZELLEN
34
4.1.1.4
KULTIVIERUNG
UND
PASSAGIEREN
VON
FDC-PL
MACL
1
ZELLEN
34
4.1.1.5
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
FDC-PL
MACL
1
ZELLEN
34
4.1.1.6
TRYPANBLAUFAERBUNG
UND
ZAEHLEN
HAEMATOPOETISCHER
SCHWIMMZELLEN
35
4.1.1.7
HERSTELLUNG
VON
ZYTOZENTRIFUGATIOSPRAEPARATEN
35
4.1.1.8
MAY-GRUENWALD
FAERBUNG
36
4.1.2
ARBEITEN
MIT
FIBROBLASTEN
36
4.1.2.1
KULTIVIERUNG
UND
PASSAGIEREN
VON
FIBROBLASTEN
36
4.1.2.2
AUFTAUEN
UND
EINFRIEREN
VON
FIBROBLASTEN
36
4.1.2.3
STIMULATION
VON
FIBROBLASTEN
37
4.1.2.4
GIEMSA
FAERBUNG
37
4.1.2.5
HERSTELLUNG
VON
KONDITIONIERTEM
MEDIUM
38
4.1.3
EINFUEHREN
VON
FREMD-DNA
IN
EUKARYOTE
ZELLEN
(TRANSFEKTION)
39
4.1.3.1
TRANSFEKTION
VON
NIH3T3
ZELLEN
NACH
DER
LIPOFEKTIN
METHODE
39
4.2
ARBEITEN
NUT
DNA
41
4.2.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
41
4.2.1.1
MINIPRAEPARATION
41
4.2.1.2
MAXIPRAEPARATION
43
4.2.2
DNA-PRAEZIPITATION
44
4.2.3
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG
45
4.2.4
AUFTRENNUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
DURCH
AGAROSE-GELELKTROPHORESE
45
4.2.4.1
HERSTELLUNG
VON
AGAROSEGELEN
45
4.2.4.2
PROBENVORBEREITUNG
UND
DURCHFUEHRUNG DER
ELEKTROPHORESE
46
4.2.5
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
UEBER
NIEDRIGSCHMELZENDE
(LOW
MELTING
POINT
LMP)
AGAROSE
46
4.2.6
LIGASEREAKTION
47
4.2.7
BAKTERIELLE
TRANSFORMATION
48
4.2.7.1
HERSTELLUNG KOMPETENTER
BAKTERIEN
48
4.2.7.2
TRANSFORMATION
MIT
REKOMBINANTER
PLASMID-DNA
48
4.2.8
OLIGONUKLEOTIDPRAEZIPITATION
49
4.2.9
REVERSE
TRANSKRIPTASEREAKTION
50
4.2.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
50
4.2.11
SOUTHERN
BLOT
UND
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-PROBEN
52
4.2.11.1
SOUTHERN
BLOT
52
4.2.11.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-PROBEN
53
4.2.11.3
REINIGUNG
DER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-PROBEN
53
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.11.4
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
AUF
SOUTHERN
TRANSFERMEMBRANEN
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-PROBEN
53
4.3
ARBEITEN
MIT
RNA
55
4.3.1
RNA-ISOLIERUNG
AUS
EUKARYOTEN
ZELLEN
55
4.3.2
PRAEPARATION
VON
POLYA+
RNA
AUS
GESAMTER
ZYTOSOLISCHER
RNA
56
4.3.3
AUF
TRENNUNG
VON
RNA-MOLEKUELEN
DURCH
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
57
4.3.3.1
HERSTELLUNG
VON
FORMALDEHYD-AGAROSEGELEN
57
4.3.3.2
PROBENVORBEREITUNG
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
FORMALDEHYD
GELELEKTROPHORESE
58
4.3.4
NORTHERN
BLOT
UND
HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-PROBEN
58
4.3.4.1
NORTHERN
BLOT
58
4.3.4.2
HYBRIDISIERUNG
DER
TRANSFERIERTEN
RNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-PROBEN
59
4.4
ARBEITEN
MIT
PROTEIN
60
4.4.1
HERSTELLUNG
VON
ZELLYSATEN
FUER
IMMUNOLOGISCHE
PROTEINNACHWEISE
60
4.4.1.1
ZELLYSATE
HAEMATOPOETISCHER
SCHWIMMZELLEN
FUER
IMMUNPRAEZIPITATIONEN
60
4.4.1.2
GESAMTZELLYSATE
AUS
HAEMATOPOETISCHEN
SCHWIMMZELLEN
61
4.4.1.3
ZELLYSATE
AUS
FIBROBLASTEN
FUER
IMMUNPRAEZIPITATIONEN
61
4.4.1.4
GESAMTZELLYSAT
AUS
FIBROBLASTEN
62
4.4.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE)
63
4.4.3
ANFERTIGUNG
VON
FLACHGELEN
64
4.4.4
FAERBEN
VON
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
NACH
DER
ELEKTROPHORESE
65
4.4.5
IMMUNPRAEZIPITATION
65
4.4.6
BESTIMMUNG
DER
IN
VITRO
KINASAAKTIVITAET
(KINASE
ASSAY)
67
4.4.7
WESTERN
BLOT
68
4.4.8
IMMUNOLOGISCHE
IDENTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
AUF
DER
WESTEM
BLOT-MEMBRAN
(IMMUNOBLOT)
69
4.4.9
GEWINNUNG
VON
POLYCLONALEM
ANTISERUM
AUS
RATTEN
69
4.4.9.1
RATTENINUNUMSIERUG
69
4.4.9.2
ANTISERUMGEWINNUNG
70
5.
ERGEBNISSE
71
5.1
DIE
NEUE
TRANS-REZEPTOR
KONTROLLE:
DIE
AKTIVIERUNG
DES
REZEPTORS
FUER
GM-CSF
KONTROLLIERT
DIE
EXPRESSION
DES
MAKROPHAGEN-SPEZIFISCHEN
M-CSF
REZEPTORS
71
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.1
FUER
DIE
TERMINALE
MAKROPHAGENDIFFERENZIERUNG
GM-CSF
STIMULIERTER
FDC-PMIX
GMV#2
ZELLEN
IST
DIE
ZUSAETZLICHE
M-CSF
STIMULATION
ERFORDERLICH
71
5.1.2
C-FINS
TRANSKRIPTE
SIND
INNERHALB
VON
2
STUNDEN
NACH
GM-CSF
STIMULATION
IN
#2
ZELLEN
NACHWEISBAR
74
5.1.3
DER
M-CSF-REZEPTOR
WIRD
6
STUNDEN
NACH
GM-CSF
STIMULATION
AUF
DER
OBERFLAECHE
VON
#2
ZELLEN
EXPRIMIERT
76
5.1.4
DER
REKONSTITUIERTE
HUMANE
GM-CSF-REZCPTOR
INDUZIERT
IN
NIH3T3
ZELLEN
DIE
EXPRESSION
VON
C-FINS
TRANSKRIPTEN
77
5.2
DIE
C-FMS
GENEXPRESSION
WIRD
IN
HAEMATOPOETISCHEN
ZELLEN
UND
IN
FIBROBLASTEN
UEBER
EINE
GM-CSF-SPEZIFISCHE
SIGNALSKASKADE
KONTROLLIERT
80
5.2.1
GM-CSF
UND
IL-3
AKTIVIEREN
DIE
RAS/RAF-1
SIGNALKASKADE
GLEICHERMASSEN
81
5.2.2
DER
RAS/RAF-1
SIGNALWEG
ALLEIN
REICHT
NICHT
AUS
UM
DIE
C-FINS
GENEXPRESSION
ZU
INDUZIEREN
83
5.2.3
DIE
MITOGENE
STIMULATION
VON
#2
ZELLEN
FUEHRT
ZUR
EXPRESSION
VON
C-MYC
85
5.2.4
NACH
IL-3
BZW.
GM-CSF
STIMULATION
IST
DER
JAK/STAT
SIGNALUEBERMITTLUNGSWEG
AKTIVIERT
87
5.3
ETABLIERUNG
VON
NIH3T3
FIBROBLASTEN,
DIE
DIE
X
UND
SS
UNTEREINHEIT
DES
HUMANEN
IL-3
REZEPTORS
EXPRIMIEREN
89
5.3.1
CHARAKTERISIERUNG
DER TRANSFEKTANTEN
89
5.3.2
IL-3
AKTIVIERT
DIE
RAS/RAF-1
SIGNALKASKADE
IN
#4
ZELLEN
91
5.3.3
DL-3
INDUZIERT
DIE
GENEXPRESSION
VON
JUNB,
NICHT
ABER
VON
C-FMS
IN
#4
ZELLEN
92
6.
DISKUSSION
94
7.
ZUSAMMENFASSUNG
103
8.
SUMMARY
104
9.
LITERATURVERZEICHNIS
105
INHALTSVERZEICHNIS
10.
ANHANG
126
10.1
ABKUERZUNGEN
126
10.2
DANKSAGUNG
130 |
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