Untersuchungen zur Transkriptionsregulation der humanen lysosomalen b-Galactosidase:
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG. 1
1.1. PROGRESSIVE SKLERODERMIE. 1
1.2. DIE HUMANE LYSOSOMALE SS-GALACTOSIDASE. 4
1.3. MECHANISMEN DER TRANSKRIPTIONSINITIATION. 6
1.4. KLASSEN VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN. 8
1.5. REGULATION DER TRANSKRIPTION VON "HOUSEKEEPING" GENEN. 12
2. AUFGABENSTELLUNG.
13
3. MATERIALIEN UND METHODEN . 14
3.1. MATERIALIEN. 14
3.1.1. CHEMIKALIEN . 14
3.1.2. BAKTERIEN UND ZELLEN . 16
3.1.3. ENZYME, COENZYME UND DNA-LAENGENSTANDARDS . 16
3.1.4. KITS FUER DIE MOLEKULARBIOLOGIE . 17
3.1.5. RADIOCHEMIKALIEN . 18
3.1.6. FOTOMATERIALIEN.\.R. 18
3.1.7. PLASMIDE. 18
3.1.9. HAEUFIG VERWENDETE LOESUNGEN . 22
3.1.10. VERWENDETE SOFTWARE. 22
3.2. METHODEN. 24
3.2.1. ALLGEMEINE NUCLEINSAEURE-TECHNIKEN . 24
3.2.1.1. QUANTIFIZIERUNG VON DNA UND RNA . 24
3.2.1.2. PHENOLEXTRAKTION UND FAELLUNG VON NUCLEINSAEUREN . 24
3.2.1.3. REINIGUNG VON DNA/RNA UEBER SEPHADEX-G50. 24
3.2.2. KLONIERUNG DES HUMANEN SS-GALACTOSIDASE-PROMOTORS. 25
3.2.2.1. PRAEPARATION CHROMOSOMALER DNA . 25
3.2.2.2. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) . 25
3.2.3. KLONIERUNG VON DNA UND VEKTORKONSTRUKTION . 25
3.2.3.1. VERDAUUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN . 25
3.2.3.2. MODIFIKATION VON RESTRIKTIONSTERMINI. 25
3.2.3.3. TRENNUNG UND ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN . 26
3.2.3.4. LIGATION . 27
3.2.3.5. KOMPETENTE ZELLEN. 27
3.2.3.6. TRANSFORMATION . 28
3.2.3.7. PRAEPARATION VON DNA . 28
3.2.3.8. SEQUENZIERUNG. 29
3.2.4. EXPRESSIONSSTUDIEN. 30
3.2.4.1. ZELLKULTIVIERUNG. 30
3.2.4.1.1. ADHAERENTE PERMANENTE ZELLEN (HEPG2, BHK21) . 30
3.2.4.1.2. IN SUSPENSION WACHSENDE PERMANENTE ZELLEN (U937). 31
3.2.4.1.3. KULTIVIERUNG PRIMAERER HUMANER HAUTFIBROBLASTEN. 32
3.2.4.1.4. INKUBATION VON ZELLKULTUREN MIT TGF-SS. 32
3.2.4.2. TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN MIT DNA . 32
3.2.4.3. ZELLEXTRAKTGEWINNUNG. 33
3.2.4.4. SS-GALACTOSIDASE-ASSAY . 34
3.2.4.5. CHLORAMPHENICOLACETYLTRANSFERASE- (CAT) ASSAY. 34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3.2.5. DNA-PROTEIN-WECHSEL WIRKUNGEN. 35
3.2.5.1. KEMEXTRAKTPRAEPARATION. 35
3.2.5.2. GESAMTZELLEXTRAKTPRAEPARATION. 36
3.2.5.3. QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG . 37
3.2.5.4. MARKIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN . 37
3.2.5.5. HERSTELLUNG DES DNA-MARKERS . 37
3.2.5.6. IN VITRO DNASE I-FOOTPRINTING-ANALYSE. 38
3.2.5.7. MARKIERUNG VON DOPPELSTRANG (DS)-OLIGONUCLEOTIDEN FUER DEN EMSA.
39
3.2.5.8. GEL-RETARDATIONSANALYSE (EMSA). 40
3.2.6. RNA-TECHNIKEN . . 40
3.2.6.1. RNA-PRAEPARATION. 40
3.2.6.2. HERSTELLUNG VON CRNA-SONDEN. 41
3.2.6.3. "RIBONCLEASE PROTECTION ASSAY" (RPA) . 41
4. ERGEBNISSE . 42
4.1. KLONIERUNG DES HUMANEN SS-GALACTOSIDASE-PROMOTORS. 42
4.1.1. AMPLIFIKATION DES PROMOTORBEREICHES . 42
4.1.2. KLONIERUNG DES PCR-PRODUKTS.^. 46
4.1.3. SEQUENZIERUNG DES SS-GALACTOSIDASEPROMOTORS . 47
4.2. CHARAKTERISIERUNG DES PROMOTORS. 50
4.2.1. UNTERSUCHUNG DER SEQUENZ UND HOMOLOGIEVERGLEICHE . 50
4.2.2. EXPRESSIONSUNTERSUCHUNGEN. 54
4.2.3. UNTERSUCHUNGEN ZU DNA-PROTEINWECHSELWIRKUNGEN. 57
4.2.3.1. IN VITRO DNASE I-FOOTPRINTING-ANALYSE. 57
4.2.3.2. GEL-RETARDATIONSANALYSE (EMSA) . 60
4.2.4. EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE TRANSKRIPTION DES HUMANEN
SS-GALACTOSIDASE-GENS 66
4.2.4.1. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON TGF-SS AUF DIE
MRNA-KONZENTRATION
VON SS-GALACTOSIDASE. 66
4.2.4.2. EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET DES
SS-GALACTOSIDASE-
PROMOTORS. 69
4.2.4.3. DNA-PROTEINWECHSELWIRKUNGEN. 71
5. DISKUSSION . 74
5.1. KLONIERUNG DES PROMOTORBEREICHES. 74
5.2. CHARAKTERISIERUNG DER S'-FLANKIERENDEN REGION DES
SS-GALACTOSIDASEGENS . 75
5.3. EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE SS-GALACTOSIDASEEXPRESSION. 83
5.4. EINORDNUNG DER ERGEBNISSE UND FOLGENDER UNTERSUCHUNGEN. 88
6. ZUSAMMENFASSUNG . 90
7. LITERATURVERZEICHNIS . 95 |
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