Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zum H2- und N2-Metabolismus in Cyanobakterien: Charakterisierung des Genlocus der bidirektionalen Hydrogenase in Anabaena variabilis ATCC 29413 und Identifizierung des nifJ-Gens in N2-fixierenden Cyanobakterien
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 181 S. Ill., graph. Darst. |
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| 245 | 1 | 0 | |a Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zum H2- und N2-Metabolismus in Cyanobakterien |b Charakterisierung des Genlocus der bidirektionalen Hydrogenase in Anabaena variabilis ATCC 29413 und Identifizierung des nifJ-Gens in N2-fixierenden Cyanobakterien |c vorgelegt von Oliver Schmitz |
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INHALI
KW
7R7FTCHNIS
1
1.
EINLEITUNG
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
7
2.1.
HERKUNFT
UND
ANZUCHT
DER
UNTERSUCHTEN
CYANOBAKTERIEN-ARTEN
7
2.1.1.
VERWENDETE
CYANOBAKTERIEN-KULTUREN:
STAMMZUGEHOERIGKEIT
UND
HERKUNFT
7
2.1.2.
ERHALTUNG
DER
KULTUREN:
ANZUCHT
IN
SCHRAEGAGARROEHRCHEN
7
2.1.3.
KULTIVIERUNG
DER
CYANOBAKTERIEN
FUER
BIOCHEMISCHE
UND
MOLEKULAR
BIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
7
2.1.3.1.
KULTIVIERUNG
VON
ANACYSTIS
NIDULANS
ZUR
REINIGUNG
DER
BIDIREK
TIONALEN
HYDROGENASE
8
2.1.3.2.
MIKROAEROBE
ANZUCHT
VON
ANACYSTIS
NIDULANS
ZUR
STEIGERUNG
DER
AKTIVITAET
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
8
2.1.3.3.
ANZUCHT
VON
ANABAENA
VARIABILIS
FUER
AKTIVITAETSBESTIMMUNGEN
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
8
2.2.
VERWENDETE
ESCHERICHIA
COLI
-
STAEMME
UND
KLONIERUNGSVEKTOREN
8
2.2.1.
ESCHERICHIA
COLI
STAEMME
ALS
WIRTSBAKTERIEN
8
2.2.2.
VERWENDETE
VEKTOREN
FUER
KLONIERUNG,
TRANSFORMATION
UND
SEQUEN
ZIERUNG
/
ANTIBIOTIKA-KONZENTRATIONEN
9
2.3.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
ZUR
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
VON
ANACYSTIS
NIDULANS
UND
ANABAENA
VARIABILIS
11
2.3.1.
ENTFERNEN
VON
SAUERSTOFF
AUS
PRAEPARATIONEN
UND
LOESUNGEN
UND
MIKRO
AEROBES
ARBEITEN
11
2.3.2.
HERSTELLUNG
VON
ROHEXTRAKTEN
FUER
AKTIVITAETSMESSUNGEN
12
2.3.3.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSE
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
WASSERSTOFFBILDUNG
UND
DER
WASSERSTOFFAUFNAHME-AKTIVITAET
12
2.3.3.1.
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAET
DER
BIDIREKTIONALENHYDROGENASE
UEBER
DIE
METHYLVIOLOGEN/NATRIUMDITHIONIT-ABHAENGIGE
H
2
-ENTWICKLUNG
12
2.3.3.2.
NAD(P)H
UND
NAD(P)H/NATRIUMDITHIONIT
ALS
ELEKTRONENDONOREN
DER
H
2
-BILDUNG
DURCH
DIE
BIDIREKTIONALE
HYDROGENASE
13
2.3.3.3.
H
2
-AUFNAHME
DURCH
DIE
BIDIREKTIONALE
HYDROGENASE
MIT
PMS
ALS
ARTIFIZIELLEM
ELEKTRONENAKZEPTOR
13
2.3.3.4.
NAD*
UND
NADP*
ALS
ELEKTRONENAKZEPTOREN
DER
H
2
-AUFNAHME
DURCH
DIE
BIDIREKTIONALE
HYDROGENASE
14
2.3.4.
BESTIMMUNG
DER
WASSERSTOFFAUFNAHME-AKTIVITAET
IN
ROHEXTRAKTEN
H
2
INDUZIERTER
ANACYSTIS
NIDULANS
-
KULTUREN
MITTELS
DER
H
2
-ELEKTRODE
14
2.4.
PROTEINREINIGUNG
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
AUS
ANACYSTIS
NIDULANS
15
2.4.1.
REINIGUNGSSCHRITTE
ZUR
ANREICHERUNG
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
15
2.4.1.1.
AUFSCHLUSS
DER
ZELLEN
DURCH
DIE
FRENCH
PRESS
15
2.4.1.2.
REINIGUNG
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
DURCH
AMMONIUMSULFAT
FAELLUNG
15
2.4.1.3.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
TRENNVERFAHREN
ZUR
REINIGUNG
DER
BIDI
16
REKTIONALEN
HYDROGENASE
2.4.1.3.1.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE-SEPHAROSE
16
2.4.1.3.2.
HYDROPHOBE
CHROMATOGRAPHIE
AN
OCTYL-SEPHAROSE
16
2.4.1.3.3.
ZWEI
AUFEINANDERFOLGENDE
REINIGUNGSSCHRITTE
DURCH
IONEN
17
AUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE-POLYMETHYLACRYLAT
BEI
PH
7,2
UND
PH
8,5
-
NUTZUNG
DER
FPLC
(AST
ARFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY)
2.4.2.
EINENGUNG
UND
ENTSALZUNG
VON
ANGEREICHERTEN
HYDROGENASE
18
PRAEPARATIONEN
2.4.3.
DENATURIERENDE
SDS-PAGE
(ALYACRYLAMID-GELDEKTROPHORESE)
ZUR
18
AUFTRENNUNG
DER
PROTEINE
IN
IHRE
UNTEREINHEITEN
2.4.3.1.
FAERBUNG
DER
PROTEINE
IM
SDS-POLYACRYLAMID-GEL
MIT
COOMASSIE
19
BRILLIANT
BLUE
2.4.3.2.
SILBERNITRATFAERBUNG
DER
SDS-POLYACRYLAMID-GELE
19
2.4.3.3.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
DER
PROTEINE
UEBER
SDS-PAGE
20
2.4.4.
ENDOPROTEOLYTISCHE
SPALTUNG
DER
HYDROGENASE-PROTEINE
IM
SDS
20
POLYACRYLATNID-GEL,
AUFTRENNUNG
DER
ENTSTANDENEN
FRAGMENTE
UEBER
HPLC
(HIGH
ARFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY)
UND
MIKROSEQUEN
ZIERUNG
DER
BRUCHSTUECKE
2.5.
PROTEINBESTIMMUNGEN
20
2.5.1.
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
NACH
DER
MIKTO-BCA
(HEIN
20
CHONINICACID)-METHODE
2.5.2.
ABSCHAETZUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
IN
HOCHREINEN
HYDROGENASE
21
FRAKTIONEN
UEBER
SDS-POLYACRYLAMID-GELE
2.6.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
22
2.6.1.
NUCLEINSAEUREISOLIERUNGEN
22
2.6.1.1.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
DEN
CYANOBAKTERIEN
22
2.6.I.2.
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
TRANSFORMIERTEN
E.
CO/7-KULTUREN
FUER
23
RESTRIKTIONSANALYSEN
UND
KLONIERUNGEN
2.6.1.3.
ISOLIERUNG
VON
BAKTERIOPHAGEN
X
-
DNA:
PLATTENLYSAT-METHODE
23
2.6.I.4.
PRAEPARATION
EINZELSTRAENGIGER
M13MPL8/MPL9-DNA
FUER
SEQUEN
24
ZIERUNGEN
2.6.2.
REINHEIT
UND
KONZENTRATIONSABSCHAETZUNG
VON
DNA
25
2.6.3.
RESTRIKTION
VON
DNA
FUER
KLONIERUNGEN
UND
WEITERE
ANALYSEN
25
2.6.3.1.
RESTRIKTION
GENOMISCHER
DNA
FUER
"SOUTHERN
BLOTS
"
UND
HYBRIDI
26
SIERUNGSEXPERIMENTE
2.6.3.2.
PARTIELLE
UND
VOLLSTAENDIGE
RESTRIKTION
GENOMISCHER
DNA
FUER
DIE
26
"INVERSE
"
PCR
2.6.3.3.
RESTRIKTION
VON
BAKTERIOPHAGEN
X-DNA
UND
PLASMIDAERER
DNA
ZUR
27
ANALYSE
KLONIERTER
DNA-FRAGMENTE
UND
FUER
SUB
UND
UMKLONIE
RUNGEN
IN
ANDERE
VEKTOREN
2.6.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
UND
GROESSENBESTIMMUNG
27
VON
DNA-FRAGMENTEN
2.6.5.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
27
2.6.5.I.
ELEKTROELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
IN
DIA
27
LYSEBEUTEL
FIIR
MARKIERUNGSEXPERIMENTE
2.6.5.2.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
UNTER
VERWEN
28
DUENG
DES
"QIAEX
GEL
EXTRACTION
KIT"
FUER
LIGATIONSANSAETZE
2.6.6.
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA-SEGMENTEN
DURCH
PCR
(ALYMERASE
CHAIN
28
REACTION)
2.6.6.1.
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUCLEOTID-PRIMERN
FUER
DIE
PCR
29
UND
FUER
SEQUENZREAKTIONEN
2.6.6.2.
ZUSAMMENSTELLUNG
DER
SYNTHETISIERTEN
OLIGONUCLEOTID-PRIMER
ZUR
29
SPEZIFISCHEN
AMPLIFIKATION
CYANOBAKTERIELLER
HYDROGENASE
UND
NIFJ
GENE
2.6.6.3.
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
UND
OPTIMIERUNG
DER
PCR-PARAMETER
29
2.6.6.4.
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA-SEGMENTEN
AUS
CIRCULARISIERTER
DNA
ALS
31
MATRIZE
DURCH
"INVERSE
"
PCR
2.6.7.
KLONIERUNGEN:
LIGATION
UND
TRANSFORMATION
32
2.6.7.1.
LIGATION
VON
PCR-PRODUKTEN
IN
DEN
VEKTOR
PCRYY
II
32
2.6.7.2.
LIGATION
PARTIELL
UND
VOLLSTAENDIG
RESTRINGIERTER
GENOMISCHER
DNA
33
FUER
DIE
"INVERSE
"
PCR
2.6.7.3.
SUBKLONIERUNG
UND
UMKLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
DEM
33
BAKTERIOPHAGEN
X
UND
DEM
VEKTOR
PCRYY
II
IN
DIE
VEKTOREN
PBLUESCRIPTYY
II
SK(-)
UND
M13MPL8/MPL9
2.6.7.4.
ERSTELLUNG
PARTIELLER
GENBANKEN
AUS
ANABAENA
VARIABILIS
IN
34
M13MPL8
UND
M13MPL9
2.6.7.5.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
SOWIE
SELEK
34
TION
POSITIVER
KLONE
2.6.8.
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUF
NITROCELLULOSE-UND
NYLON-MEMBRANEN
36
2.6.8.1.
UEBERTRAGUNG
VON
RESTRINGIERTER
DNA
AUS
EINEM
AGAROSE-GEL
AUF
36
NITROCELLULOSE
UND
NYLON-MEMBRANEN
DURCH
"SOUTHERN
TRANSFER
"
2.6.8.2.
ANFERTIGUNG
VON
NITROCELLULOSE-FILTERN
ZUR
HYBRIDISIERUNG
VON
36
BAKTERIOPHAGEN
X
UND
M13MPL8/MPL9-KLONEN
2.6.8.3.
TRANSFER
VON
BAKTERIENKOLONIEN
AUF
NITROCELLULOSE
UND
NYLON
37
MEMBRANEN
FUER
KOLONIE-HYBRIDISIERUNGEN
2.6.9.
HERSTELLUNG
VON
DNA-SONDEN
FUER
HYBRIDISIERUNGEN
37
2.6.9.1.
32
P-MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
DURCH
"NICK
TRANSLATION
"
37
2.6.9.2.
MARKIERUNG
VON
DNA-SONDEN
MIT
DIGOXIGENIN
38
2.6.9.2.1.
MARKIERUNG
MITTELS
PCR
38
2.6.9.2.2.
MARKIERUNG
DURCH
"RANDOM
PRIMING
"
38
2.6.10.
HYBRIDISIERUNG
DER
FILTER
MIT
DEN
MARKIERTEN
SONDEN
39
2.6.10.1.
HYBRIDISIERUNG
MIT
32
P-MARKIERTEN
DNA-SONDEN
39
2.6.10.2.
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIGOXIGENIN-MARKIERTEN
DNA-PROBEN
40
2.6.10.2.1.
DETEKTION
HYBRIDISIERENDER
DNA
DURCH
WASCHEN
UND
FAERBEN
DER
40
FILTER
2.6.10.2.2.
WIEDERVERWENDUNG
HYBRIDISIERTER
NYLON-MEMBRANEN
DURCH
ENT
41
FERNEN
DES
ANTIKOERPER-KONJUGATES
UND
DER
GEBUNDENEN
DNA-SONDE
2.6.11.
SEQUENZIERUNG
EINZELSTRAENGIGER
M13MPL8/MPL9-DNA
41
2.6.11.1.
SEQUENZREAKTION:
MARKIERUNG
DES
ZU
SEQUENZIERENDEN
DNA-FRAG
41
MENTES
MIT
3S
S-DATP
UND
POLYMERISIERUNG
DURCH
TAQ-POLYMERASE
2.6.11.2.
TRENNUNG
DER
3S
S-MARKIERTEN
FRAGMENTE
DURCH
PAGE
UND
WEITER
42
BEHANDLUNG
DES
SEQUENZGELS
2.6.11.3.
ERZEUGUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
UEBERLAPPENDEN
M13-DELETIONS
42
KLONEN
ZUR
VOLLSTAENDIGEN
SEQUENZIERUNG
INTERNER
SEQUENZBEREICHE
DER
KLONIERTEN
DNA-FRAGMENTE
("NESTED
DELETION
"
)
2.6.11.4.
EINSATZ
SPEZIFISCHER
OLIGONUCLEOTIDE
ALS
SEQUENZ-PRIMER
ZUR
VER
44
VOLLSTAENDIGUNG
VERBLEIBENDER
SEQUENZLUECKEN
2.7.
ANALYSE
VON
DNA
UND
PROTEINSEQUENZEN
MITTELS
COMPUTER
44
2.7.1.
ANALYSE
UND
TRANSLATION
VON
DNA-SEQUENZEN
UND
CHARAKTERISTIKA
DER
44
ABGELEITETEN
PROTEINSEQUENZEN
2.7.2.
ERMITTLUNG
KONSERVIERTER
DOMAENEN
DURCH
VERRECHNUNG
VON
SEQUENZEN
45
UND
BERECHNUNG
VON
SEQUENZVERWANDTSCHAFTEN
2.7.3.
SUCHE
NACH
HOMOLOGEN
DNA
UND
PROTEINSEQUENZEN
IN
VERSCHIEDENEN
45
DATENBANKEN
3.
ERGEBNISSE
46
3.1.
VORGEHENSWEISE
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
VON
HYDROGENASE-GENEN
IN
CYANO
46
BAKTERIEN
3.1.1.
KONSTRUKTION
VON
OLIGONUCLEOTID-PRIMERN
GEGEN
DEN
N-TERMINUS
DER
46
KLEINEN
UNTEREINHEIT
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
AUS
ANACYSTIS
NIDULANS
UND
EINSATZ
DIESER
PRIMER
IN
DER
"INVERSEN
"
PCR
3.1.2.
PROTEINREINIGUNG
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
AUS
ANACYSTIS
48
NIDULANS
ZWECKS
BESTIMMUNG
INTERNER
PROTEINSEQUENZEN
3.1.3.
LYSC-SPALTUNG
DER
HYDROGENASE-PROTEINE
UND
SEQUENZEN
DER
UEBER
50
HPLC
GETRENNTEN
FRAGMENTE
3.1.4.
EINSATZ
DER
PCR
ZUR
AMPLIFIZIERUNG
VON
HYDROGENASE-GENSEGMENTEN
52
MIT
HILFE
VON
OLIGONUCLEOTID-PRIMERN
AUS
KONSERVIERTEN
GENBEREICHEN
BEKANNTER
HYDROGENASEN
3.1.4.1.
KONSERVIERTE
DOMAENEN
INNERHALB
DER
KLEINEN
UNTEREINHEIT
VON
53
HYDROGENASEN
3.1.4.2.
VERGLEICH
DER
SEQUENZEN
DER
GROSSEN
UNTEREINHEITEN
55
3.2.
CHARAKTERISIERUNG
CYANOBAKTERIELLER
HYDROGENASE-GENE
60
3.2.1.
AMPLIFIZIERUNG
EINES
1,35
KB
GROSSEN
GENSEGMENTES
DER
GROSSEN
UNTER
60
EINHEIT
EINER
HYDROGENASE
AUS
ANABAENA
7119
UND
ANACYSTIS
NIDULANS
UND
SEQUENZIERUNG
DES
A.
7119-AMPLIFIKATES
3.2.2.
HYBRIDISIERUNGSEXPERIMENTE
ZUM
VORKOMMEN
VON
HYDROGENASE-GENEN
64
IN
VERSCHIEDENEN
CYANOBAKTERIEN-ARTEN
UNTER
VERWENDUNG
DER
1,35
KB
PROBE
AUS
DEM
GEN
DER
GROSSEN
UNTEREINHEIT
DER
HYDROGENASE
AUS
A.
7119
3.2.2.I.
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNGEN
MIT
GENOMISCHER
DNA
VON
ANABAENA
65
7119,
A.
VARIABILIS,
A.
CYLINDRICA
UND
ANACYSTIS
NIDULANS
3.2.2.2.
SOUTHERN
UND
KOLONIE-HYBRIDISIERUNG
MIT
SYNECHOCYSTIS
6803:
IDEN
67
TIFIZIERUNG
POTENTIELLER
HYDROGENASE-GENE
TRAGENDER
COSMID-KLONE
3.2.3.
ISOLIERUNG,
SUBKLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
VON
HYDROGENASE-GENEN
AUS
ANABAENA
VARIABILIS
69
3.2.3.1.
ISOLIERUNG
POSITIVER
KLONE
EINER
BAKTERIOPHAGEN
X
GENBANK
VON
ANABAENA
VARIABILIS
DURCH
HYBRIDISIERUNG
MIT
DER
1,35
KB-PROBE
AUS
A.
7119
69
3.2.3.2.
SCREENING
DER
X-GENBANK
VON
A.
VARIABILIS
MIT
EINER
1,9
KB
GROSSEN
HOXF-GENPROBE
AUS
X46
ZUR
VERVOLLSTAENDIGUNG
DES
HYDROGENASE
CLUSTERS:
ISOLIERUNG
EINES
TRANSKRIPTIONELLEN
MERR-HOMOLOGEN
AKTIVATORGENS
72
3.2.3.3.
ISOLIERUNG
WEITERER
HYDROGENASE-KLONE
AUS
PARTIELLEN
GENBANKEN
VON
A.
VARIABILIS
IN
MI3MPL8
UND
M13MPL9
74
3.2.4.
STRATEGIE
DER
SEQUENZIERUNG
EINER
8927
BP
GROSSEN
HYDROGENASE-GENE
TRAGENDEN
DNA-REGION
AUS
ANABAENA
VARIABILIS
76
3.2.5.
SEQUENZANALYSE
DER
HYDROGENASE-REGION
VON
ANABAENA
VARIABILIS
78
3.2.5.I.
NUCLEOTIDSEQUENZ
UND
ABGELEITETE
PROTEINSEQUENZEN
DES
GESAMTEN
8927
BP
GROSSEN
HYDROGENASE-CLUSTERS
78
3.2.5.2.
HOXH
UND
HOXY,
DIE
UNTEREINHEITEN
DES
HYDROGENASE-HETERO
DIMERS
-
SEQUENZCHARAKTERISTIKA
UND
VERGLEICH
ZU
SEQUENZEN
ANDERER
HYDROGENASE-PROTEINE
85
3.2.5.2.I.
HOXH:
GROSSE
UNTEREINHEIT
DES
HYDROGENASE-DIMERS
85
3.2.5.2.2.
HOXY:
KLEINE
UNTEREINHEIT
DES
HYDROGENASE-DIMERS
87
3.2.5.3.
HOXF
UND
HOXU,
DIE
UNTEREINHEITEN
DES
DIAPHORASE-HETERODIMERS
-
SEQUENZCHARAKTERISTIKA
UND
VERGLEICH
ZU
SEQUENZEN
ANDERER
HYDROGENASE
PROTEINE
88
3.2.5.3.I.
HOXF:
GROSSE
UNTEREINHEIT
DES
DIAPHORASE-DIMERS
89
3.2.5.3.2.
HOXU:
KLEINE
UNTEREINHEIT
DES
DIAPHORASE-DIMERS
89
3.2.5.4.
ORF3,
ORF5,
ORF6
UND
ORF8:
VIER
OFFENE
LESERASTER
UNBEKANNTER
FUNKTION
91
3.2.5.5.
MUTMASSLICHE
RIBOSOMEN-BINDUNGSSTELLEN,
PROMOTOR-KONSENSUS
SEQUENZEN
UND
TERMINATIONSSTELLEN
DER
TRANSKRIPTION
92
3.2.S.6.
CODON-BENUTZUNG
DER
ACHT
LESERASTER
93
3.2.5.7.
ANALYSE
DER
FUER
CYANOBAKTERIEN-SEQUENZEN
TYPISCHEN
TANDEMARTIG
WIEDERHOLTEN
HEPTAMER
UND
OCTAMER-DNA-MOTIVE
96
3.2.6.
SEQUENZHOMOLOGIEN
ZWISCHEN
DEN
PROTEINSEQUENZEN
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
AUS
ANACYSTIS
NIDULANS
UND
DEN
ABGELEITETEN
PROTEIN
SEQUENZEN
DER
ANABAENA
VARIABILIS
-
HYDROGENASE
97
3.2.7.
ZUSAMMENFASSENDER
VERGLEICH
DER
SEQUENZAEHNLICHKEITEN
DER
TETRA
MEREN,
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
VON
A.
VARIABILIS
ZU
HYDROGENASEN
ANDERER
ORGANISMEN
UND
VERWANDTEN
PROTEINEN
98
3.3.
NAD(P)
+
-REDUKTION
UND
NAD(P)H-OXIDATION
DURCH
DIE
BIDIREKTIONALEN
101
HYDROGENASEN
VON
ANACYSTIS
NIDULANS
UND
ANABAENA
VARIABILIS
3.3.1.
NAD(P)H-ABHAENGIGE
H
2
-PRODUKTION
101
3.3.1.1.
NAD(P)H-ABHAENGIGE
H
2
-PRODUKTION
IN
ROHEXTRAKTEN
VON
A.
NIDU
LANS
UND
A.
VARIABILIS
UND
STEIGERUNG
DER
NAD(P)H-ABHAENGIGEN
H
2
-PRODUKTION
IN
ROHEXTRAKTEN
VON
A.
NIDULANS
DURCH
MIKROAEROBE
INKUBATION
DER
KULTUR
101
3.3.1.2.
NAD(P)H-ABHAENGIGE
H
2
-PRODUKTION
IN
GEREINIGTEN
HYDFOGENASE
103
FRAKTIONEN
VON
A.
NIDULANS
3.3.2.
NAD(P)*-ABHAENGIGE
H
2
-AUFNAHME
104
3.3.2.1.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
MESSUNGEN
104
3.3.2.2.
MESSUNGEN
MIT
DER
H
2
-ELEKTRODE
106
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
VORKOMMEN
DES
PYRUVAT:FERREDOXIN(FLAVODOXIN)
107
OXIDOREDUKTASE-GENS,
NIFJ,
IN
CYANOBAKTERIEN
3.4.1.
PCR-AMPLIFIZIERUNG
EINES
NIFJ
GENSEGMENTES
AUS
A.
VARIABILIS
UND
107
A.
7119
3.4.2.
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DER
NIFJ
REGION
IN
A.
7119
108
3.4.3.
ERWEITERUNG
DER
NIFJ
SEQUENZ
VON
A.
7119
DURCH
"INVERSE
"
PCR
UND
109
VERGLEICH
MIT
NIFJ
SEQUENZEN
ANDERER
ORGANISMEN
3.4.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PRAESENZ
VON
NIFJ
IN
A.
NIDULANS:
PCR
UND
HYBRI
114
DISIERUNG
4.
DISKUSSION
116
4.1.
DER
GENLOCUS
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
IN
A.
VARIABILIS:
VER
117
GLEICH
ZU
HYDROGENASEN
UND
VERWANDTEN
PROTEINEN
ANDERER
ORGANISMEN
UND
HOMOLOGIEN
ZUR
GEREINIGTEN
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
AUS
A.
NIDULANS
4.1.1.
AMPLIFIZIERUNG
EINES
HYDROGENASE-GENSEGMENTES
DURCH
PCR
UND
117
ISOLIERUNG
DES
HYDROGENASE-LOCUS
AUS
A.
VARIABILIS
4.1.2.
HOMOLOGIEN
ZU
ANDEREN
PROTEINEN
UND
SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
POTEN
119
TIELLE
BINDUNGSSTELLEN
VON
[FESL-ZENTREN,
NAD(P)
+
,
FMN
UND
NICKEL
4.1.3.
LOKALISIERUNG
DER
HYDROGENASE-GENE
IN
A.
VARIABILIS
IM
VERGLEICH
126
ZUR
ORGANISATION
DER
GENLOCI
IN
ANDEREN
ORGANISMEN
4.1.4.
EINORDNUNG
DER
CYANOBAKTERIEN-HYDROGENASEN
GEMAESS
DER
VON
WU
UND
130
MANDRAND
(1993)
VORGENOMMENEN
KLASSIFIZIERUNG
DER
HYDROGENASEN
4.1.5.
REINIGUNG
DER
BIDIREKTIONALEN
HYDROGENASE
AUS
A.
NIDULANS
UND
HOMO
135
LOGIEN
ZUM
HYDROGENASE-CLUSTER
VON
A.
VARIABILIS
4.2.
BIDIREKTIONALE
HYDROGENASE-GENE
IN
ANDEREN
CYANOBAKTERIEN
138
4.3.
BESTAETIGUNG
DER
NAD(P)*-REDUZIERENDEN
AKTIVITAET
DER
BIDIREKTIONALEN
140
HYDROGENASE
DURCH
ENZYMATISCHE
MESSUNGEN
4.4.
VORKOMMEN
VON
NIFJ
HOMOLOGEN
GENEN
IN
N
2
-FIXIERENDEN.
HETERO
148
CYSTEN-ENTHALTENDEN
CYANOBAKTERIEN
DER
GATTUNG
ANABAENA:
DIE
ROLLE
DER
PYRUVAT:FERREDOXIN(FLAVODOXIN)-OXIDOREDUKTASE
BEI
DER
GENERIERUNG
VON
REDUKTIONSAEQUIVALENTEN
FUER
DIE
N
2
-FIXIERUNG
4.5.
ERSTMALIGER
NACHWEIS
EINES
MERR-HOMOLOGEN
TRANSKRIPTIONELLEN
155
AKTIVATORGENS
IN
CYANOBAKTERIEN
5.
ZUSAMMENFASSUNG
157
6.
ANHANG:
ZUSAMMENSETZUNG
DER
MEDIEN
UND
PUFFER
160
LOESUNGEN
6.1.
MEDIUM
ZUR
ANZUCHT
DER
CYANOBAKT
ER
IEN-KULTUR
EN
160
6.2.
MEDIEN
ZUR
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
161
6.3.
ZUSAMMENSETZUNG
DER
LOESUNGEN
FUER
POLYACRYLAMID-GELE
161
6.3.1.
SDS-PAGE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
161
6.3.2.
DNA-SEQUENZGELE
162
6.4.
LOESUNGEN
FUER
DIE
MIKRO-BCA-PROTEINBESTIMMUNG
162
6.5.
LOESUNGEN
UND
PUFFER
FUER
MOLEKULARBIOLOGISCHE
ARBEITEN
162
6.6.
SYMBOLE
FUER
AMINOSAEUREN
163
6.7.
DER
GENETISCHE
STANDARDCODE
164
6.8.
DNA-GROEBENMARKER
164
7.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
165
8.
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
UND
TABELLEN
167
9.
LITERATURVERZEICHNIS
169 |
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| author | Schmitz, Oliver |
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| spellingShingle | Schmitz, Oliver Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zum H2- und N2-Metabolismus in Cyanobakterien Charakterisierung des Genlocus der bidirektionalen Hydrogenase in Anabaena variabilis ATCC 29413 und Identifizierung des nifJ-Gens in N2-fixierenden Cyanobakterien Pyruvatsynthase (DE-588)4176544-8 gnd Gen (DE-588)4128987-0 gnd Cyanobakterien (DE-588)4136726-1 gnd Genort (DE-588)4206912-9 gnd Hydrogenasen (DE-588)4160910-4 gnd Anabaena variabilis (DE-588)4201061-5 gnd |
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