Molekulare Charakterisierung von Proteinen der inneren und äußeren Plastiden-Hüllmembran:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
D
ER
CHLOROPLASTIDAERE
P
HOSPHAT
/T
RIOSEPHOSPHAT
-T
RANSLOKATOR
.
2
1.2.
D
AS
37
K
D
A
-P
ROTEIN
DER
INNEREN
C
HLOROPLASTENHUELLMEMBRAN
.
3
1.3.
D
AS
6,7
K
D
A
-P
ROTEIN
DER
AUBEREN
C
HLOROPLASTENHUELLMEMBRAN
.
3
1.4.
D
AS
PLASTIDAERE
P
ORIN
.
4
1.5.
D
AS
24
K
D
A
-P
ROTEIN
.
4
1.6.
D
ER
2-O
XOGLUTARAT
/M
ALAT
-T
RANSLOKATOR
DER
INNEREN
C
HLOROPLASTENHUELLMEMBRAN
.
4
1.7.
D
ER
ATP/ADP-T
RANSLOKATOR
DER
INNEREN
C
HLOROPLASTENHUELLMEMBRAN
.
6
1.8.
D
ER
H
EXOSE
-P
HOSPHAT
-T
RANSLOKATOR
DER
P
LASTIDENHUELLMEMBRAN
.
7
1.9.
D
AS
G
LYKOLAT
/G
LYZERAT
-T
RANSPORTSYSTEM
.
7
1.10.
A
NSAETZE
ZUR
MOLEKULAREN
C
HARAKTERISIERUNG
VON
P
ROTEINKOMPONENTEN
DER
P
LASTIDENHUELLMEMBRAN
.
8
1.11.
Z
IELSETZUNG
DER
A
RBEIT
.
9
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
10
2.1.
I
SOLATION
VON
O
RGANELLEN
UND
O
RGANELLHUELLMEMBRANEN
.
10
2.1.1.
PFLANZENMATERIAL
.
10
2.1.2.
ISOLATION
VON
CHLOROPLASTEN
AUS
SPINAT
.
10
2.1.3.
ISOLATION
VON
CHLOROPLASTEN
AUS
ERBSENBLAETTERN
.
11
2.1.4.
ISOLATION
VON
NICHTGRUENEN
PLASTIDEN
AUS
BLUMENKOHLKOEPFEN
.
11
2.1.5.
REINIGUNG
INTAKTER
CHLOROPLASTEN
MITTELS
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
12
2.1.6.
REINIGUNG
INTAKTER
NICHTGRUENER
PLASTIDEN
AUS
BLUMENKOHL
MITTELS
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.
13
2.1.7.
ISOLATION
VON
CHLOROPLASTENHUELLMEMBRANEN
AUS
SPINAT
UND
ERBSE
.
13
2.1.3.
ISOLATION
VON
HUELLMEMBRANEN
NICHTGRUENER
PLASTIDEN
AUS
BLUMENKOHLKOEPFEN
.
14
2.2.
G
ELELEKTROPHORESE
VON
P
ROTEINEN
UND
N
UKLEINSAEUREN
.
14
2.2.1.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
NACH
LAEMMLI
.
14
2.2.2.
TRICIN-SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
NACH
SCHAEGGER
UND
V.
JAGOW
.
16
2.2.3.
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
16
2.2,4.
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
COOMASSIE-BRILLIANTBLAU
.
17
2.2.5.
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
SILBEMITRAT
.
17
2.2.6.
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
KUPFERCHLORID
.
19
2.2.7.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
DESOXYRIBONUKLEINSAEUREN
.
19
2.2.8.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
VON
RIBONUKLEINSAEUREN
(RNA)
.
20
2.2.9.
PLUOROGRAPHIE
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
.
21
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.10.
AUTORADIOGRAPHIE
VON
POLYACRYLAMIDGELEN
UND
NYLONFIITEM
.
21
2.2.11.
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
VON
AUTORADIOGRAPHIEN
.
21
2.3.
T
RANSFER
VON
M
AKROMOLEKUELEN
AUF
IMMOBILISIERENDE
M
EMBRANEN
("B
LOTTING
")
.
22
2.3.1.
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINMOLEKUELEN
AUF
MEMBRANEN
(
"
WESTERN
BLOT")
UND
ANSCHLIESSENDE
DETEKTION
DER
PROTEINE
MIT
COOMASSIE
BRILLIANTBLAU
ODER
ANTIKOERPERN
.
22
2.3.2.
KAPILLARTRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
MEMBRANEN
("SOUTHERN"
BZW.
"NORTHEM-BLOT")
.
24
2.4.
C
HEMISCHE
UND
ENZYMATISCHE
S
PALTUNG
VON
P
ROTEINEN
IN
EINER
P
OLYACRYLAMIDGEL
-M
ATRIX
25
2.4.1.
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
PROTEINEN
IN
DER
GELMATRIX
.
25
2.4.2.
CHEMISCHE
SPALTUNG
VON
PROTEINEN
IN
EINER
GELMATRIX
MIT
BROMCYAN
.
26
2.5.
T
RENNUNG
VON
P
EPTIDEN
MIT
H
OCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
.
27
2.6.
F
AELLUNGSMETHODEN
FUER
P
ROTEINE
.
28
2.6.1.
DENATURIERENDE
FAELLUNG
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
(TCA)
.
28
2.6.2.
DENATURIERENDE
FAELLUNG
MIT
CHLOROFBRM/METHANOL
.
28
2.6.3.
DENATURIERENDE
FAELLUNG
MIT
ACETON
.
28
2.6.4.
FAELLUNG
MIT
ETHANOL
.
28
2.6.5.
FAELLUNG
MIT
POLYETHYLENGLYKOL
.
29
2.7.
ISOLATION
VON
RNA
AUS
PFLANZENGEWEBE
.
29
2.7.1.
ENTNAHME
VON
BLATTPROBEN
.
30
2.7.2.
VORBEREITUNG
FUER
DIE
EXTRAKTION
.
30
2.7.3.
EXTRAKTION
.30
2.7.4.
ISOPROPANOL
FAELLUNG
.
30
2.7.5.
SAURE
ETHANOLFALLUNG
.
31
2.7.6.
WASCHEN
MIT
NA-ACETAT
UND
ETHANOL
.
31
2.7.7.
AUFNEHMEN
DES
SEDIMENTS
.
31
2.7.8.
QUANTIFIZIERUNG
DES
RNA-GEHALTS
.
31
2.8.
E
XTRAKTION
GENOMISCHER
DNA
AUS
P
FLANZENGEWEBE
.
32
2.8.1.
EXTRAKTION
DER
DNA
.
32
2.8.2.
KONZENTRIERUNG
UND
ENTSALZUNG
DER
DNA
DURCH
FAELLUNG
.
33
2.8.3.
RNASE
VERDAU
DER
DNA
.
33
2.8.4.
QUANTIFIZIERUNG
DER
DNA
.
33
2.9.
A
GROBACTERIUM
TUMEFACIENS
VERMITTELTE
T
RANSFORMATION
VON
T
ABAK
-P
FLANZEN
.
34
2.9.1.
STERILISATION
VON
TABAK-SAMEN
UND
ANZUCHT
VON
STERILEM
PFLANZENMATERIAL
.35
2.9.2.
TRANSFORMATION
VON
A.
TUMEFACIENS
.
35
2.9.3.
TRANSFORMATION
VON
PFLANZEN
.
35
2.9.4.
KALLUS
UND
SPROSSINDUKTION
.
36
2.9.5.
REGENERATION
VON
PFLANZEN
.
.36
2.10.
E.
COLI
-S
TAEMME
,
A
NZUCHT
UND
L
AGERUNG
VON
E.
COLI
-S
TAEMMEN
.
37
2.11.
T
RANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
37
2.11.1.
HERSTELLUNG
VON
TSS
.
37
INHALTSVERZEICHNIS
III
2.11.2.
TRANSFORMATION
UND
LAGERUNG
DER
KOMPETENTEN
ZELLEN
.38
2.12.
A
NZUCHT
,
T
RANSFORMATION
UND
A
UFSCHLUE
VON
H
EFEZELLEN
(S
CHIZOSACCHAROMYCES
POMBE
)38
2.12.1.
ANZUCHT,
AUSPLATTIERUNG
UND
LAGERUNG
VON
HEFEZELLEN
.
38
2.12.2.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
HEFEZELLEN
UND
TRANSFORMATION
.
39
2.12.3.
ERNTE
UND
AUFSCHLUSS
DER
HEFEZELLEN
.
40
2.13.
M
ESSUNG
DER
T
RANSPORTEIGENSCHAFTEN
VON
M
EMBRANPROTEINEN
IN
KUENSTLICHEN
L
IPOSOMEN
40
2.13.1.
REINIGUNG
VON
PHOSPHOLIPIDEN
.
40
2.13.2.
REKONSTITUTION
VON
REKOMBINANTEM
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATOR
IN
LIPOSOMEN
.
41
2.13.3.
MESSUNG
DES
MALAT-TRANSPORTS
.
42
2.14.
W
EITERE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
M
ETHODEN
.
43
3.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.
44
3.1.
D
ER
2-O
XOGLUTARAT
/M
ALAT
T
RANSLOKATOR
DER
INNEREN
C
HLOROPLASTEN
-H
UELLMEMBRAN
VON
S
PINAT
.
44
3.1.1.
PEPTIDSEQUENZEN
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT
TRANSLOKATORS
.
44
3.1.2.
VERSUCHE
ZUR
KLONIERUNG
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT
TRANSLOKATORS
.
45
3.1.3.
ANALYSE
DER
NUKLEOTIDSEQUENZ
UND
DER
DARAUS
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
2
OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORS
AUS
SPINAT
.
48
3.1.4.
ANALYSE
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORS
AUS
SPINAT
.
53
3.1.5.
IMPORT
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORS
IN
CHLOROPLASTEN
.
59
3.1.6.
FUNKTIONALE
EXPRESSION
DES
CHLOROPLASTIDAEREN
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORS
IN
S.
POMBE
.
62
3.1.7.
KONSTRUKTION
DES
HEFE-EXPRESSIONSPLASMIDS
PEVPLL-211
.
62
3.1.8.
TRANSFORMATION
VON
S.
POMBE
MIT
DEM
KONSTRUKT
PEVPLL-211
.
63
3.1.9.
ANALYSE
DER
LEUCIN-AUXOTROPHEN
HEFETRANSFORMANTEN
IM
REKONSTITUIERTEN
SYSTEM
.
65
3.2.
I
SOLATION
DES
2-O
XOGLUTARAT
/M
ALAT
-T
RANSLOKATORS
AUS
T
ABAK
.
68
3.2.1.
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
REIFEN
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORS
AUS
TABAK
.
69
3.2.2.
ANALYSE
DER
KOPIENZAHL
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORGENES
IN
TABAK
.
72
3.2.3.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATOR-GENES
IN
TABAK
BEI
ANZUCHT
MIT
VERSCHIEDENEN
NITRATKONZENTRATIONEN
.
73
3.2.4.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATOR-GENES
IN
TABAK
UND
SPINAT
UNTER
PHOTORESPIRATORISCHEN
BEDINGUNGEN
.
76
3.2.5.
KONSTITUTIVE
EXPRESSION
DES
2-OXOGLUTARAT/MALAT-TRANSLOKATORS
AUS
SPINAT
IN
TRANSGENEM
TABAK
UNTER
KONTROLLE
DES
CAMV
35S-PROMOTORS
.
79
3.2.6.
ANALYSE
DES
GESAMT
KOHLENSTOFF
ZU
GESAMTSTICKSTOFF-VERHAELTNISSES
(C/N-VERHAELTNIS)
IN
DEN
TRANSGENEN
TABAK-LINIEN
A
UND
B
.
84
3.3.
D
AS
24
K
D
A
P
ROTEIN
DER
A
UBEREN
C
HLOROPLASTEN
-H
UELLMEMBRAN
.
87
3.3.1.
PEPTIDSEQUENZEN
DES
24
KDA
PROTEINS
.
87
3.3.2.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
24
KDA
PROTEINS
.
88
3.3.3.
ANALYSE
DER
PROTEINSEQUENZ
DES
24
KDA
PROTEINS
.
88
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.4.
IN
VIVO
EXPRESSION
DES
24
KDA
PROTEINS
UND
AFFINITAETSREINIGUNG
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
AN
NI
2+
~NTA-AGAROSE
.
92
3.3.5.
CHEMISCHE
SPALTUNG
DES
24
KDA-PROTEINS
UND
ANALYSE
DES
PROTEINS
IN
VERSCHIEDENEN
GELSYSTEMEN
.94
3.3.6.
ZIRKULAR
DICHROISMUS-ANALYSE
(CD)
DES
24
KDA-PROTEINS
DER
AEUSSEREN
CHLOROPLASTEN-HUELLMEMBRAN
UND
DES
TRIOSEPHOSPHAT-TRANSLOKATORS
DER
INNEREN
CHLOROPLASTEN-HUELLMEMBRAN
.
96
3.4.
V
ERSUCHE
ZUR
I
DENTIFIKATION
EINES
H
EXOSE
-P
HOSPHAT
-T
RANSLOKATORS
AUS
NICHTGRUENEN
P
LASTIDEN
.
99
3.4.1.
DAS
30
KDA-PROTEIN
AUS
DEN
HUELLMEMBRANEN
VON
ERBSENWURZEL-PLASTIDEN
IST
EIN
PORIN
.
100
3.4.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
30
KDA-PROTEINE
DER
HUELLMEMBRAN
VON
BLUMENKOHL-INSSORESZENZ-PLASTIDEN.L04
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
106
5.
LITERATURVERZEICHNIS
.
108
6.
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN.
.112 |
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