Proteintransport ins endoplasmatische Retikulum: zum Verständnis des SRP-mediierten Translationsarrestes und zur biochemischen Charakterisierung von am Transport sekretorischer Vorstufen ins endoplasmatische Retikulum beteiligten Proteinen
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| Format: | Buch |
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
11.
DIE
ZELLE
1
12.
PROTEINTRANSPORT
UEBER
DIE
MEMBRAN
DES
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUMS
2
1.3.
DIE
SIGNALHYPOTHESE
2
1.4.
DIE
ZWEI
MECHANISMEN
DES
SIGNALPEPTID-ABHAENGIGEN
PROTEIN
TRANSPORTES
3
1.4.1.
RIBONUKLEOPROTEINPARTIKEL-(RNP)-ABHAENGIGER
TRANSPORT
VON
PROTEINEN
IN
DAS
ENDOPLASMATISCHE
RETIKULUM
AUS
HUNDEPANKREAS
4
1.4.2.
RIBONUKLEOPROTEINPARTIKEL-(RNP)-UNABHAENGIGER
TRANSPORT
SEKRETORISCHER
PROTEINE
IN
DAS
ENDOPLASMATISCHE
RETIKULUM
AUS
HUNDEPANKREAS
9
1.5.
KOMPONENTEN
BEIDER
TRANSPORTWEGE
12
1.5.1.
SULFHYDRYL-MODIFIZIERENDE
AGENZIEN
12
1.5.2.
PHOTOAFFINITAETS-MODIFIZIERUNG
MIT
8-AZIDO-ATP
13
1.5.3.
DER
SIGNALPEPTIDREZEPTOR
14
1.6.
DAS
KONZEPT
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
15
2.
MATERIAL UND
METHODEN
17
2.1.
MATERIAL
17
2.1.1.
CHEMIKALIEN
17
2.1.2.
GERATE
17
METHODEN
2.2.
IN
VITRO-SYNTHESE
VON
PROTEINEN
18
2.2.1.
TRANSKRIPTION
MIT
SP6
RNS-POLYMERASE
18
2.2
2.
IN
VITRO-PROTEINSYNTHESE
IM
WEIZEMKEIMLYSAT
19
2.3.
TRANSPORT
VON
VORSTUFENPROTEINEN
IN
MIKROSOMEN
21
2
3.1.
PRAEPARATION
VON
MIKROSOMEN
AUS
HUNDEPANKREAS
21
2.3.2.
VORBEHANDLUNG
VON
MIKROSOMEN
22
2.3.3.
TEST
AUF
PROTEINTRANSFER
IN
MIKROSOMEN
26
2.4.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINGEMISCHEN
27
2.4.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
27
2
4
2.
HOCHAUFLOESENDE
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
29
2.5.
FAERBUNG
VON
GELEN
35
2.6.
IMMUNOBLOTTING
37
2.7.
FLUOROGRAPHIE
UND
DENSITOMETRIE
38
3.
ERGEBNISSE
39
3.1.
QUANTITATIVE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INTERAKTION
VON
SRP
UND
DER
SIGNALSEQUENZ
SEKRETORISCHER
VORSTUFEN
39
3.1.1.
VORAUSSETZUNGEN
FUER
TRANSLATIONSARRESTUNTERSUCHUNGEN
39
3.1.2.
SRP-ARREST-EXPERIMENTE
IN
DER
TRANSLATION
SEKRETORISCHER
VORSTUFEN
39
3.1.2.1.
ETABLIERUNG
EINES
VERSUCHSAUFBAUS
39
3.1.2.2.
AUSWAHL
DER
PROTEINE
49
3.1.2.3.
AUFBAU
DER
SRP-ARREST-VERSUCHE
52
3.1.3.
DIE
VERSUCHSANORDNUNG
FUHRT
ZU
REPRODUZIERBAREN
ERGEBNISSEN
IN
DER
QUANTIFIZIERUNG
DER
SRP-SIGNALSEQUENZ-WECHSELWIRKUNG
54
3.1.3.1.
DIE
VERSUCHSERGEBNISSE
KORRELIEREN
GUT
MIT
BEREITS
BEKANNTEN
DATEN
54
3.1.3.2.
DIE
QUANTIFIZIERUNG
DER
ARRESTEXPERIMENTE
56
3.1.4.
DIE
EFFIZIENZ
DER
PROTEIN-SRP-WECHSELWIRKUNG
IST
LAENGENABHAENGIG
UND
WEIST
AUF
DIE
NOTWENDIGKEIT
EINES
RNP-UNABHAENGIGEN
TRANSPORTS
HIN
66
3.1.4.1.
DER
VERSUCHSAUFBAU
ERFUELLT
DIE
AUFGESTELLTEN
KRITERIEN
66
3.1.4.2.
DIE
BINDUNG
VON
SRP
AN
DIE
SS
IST
SPEZIFISCH
UND
UNABHAENGIG
VON
DER
PRIMAERSTRUKTUR
DES
REIFEN
PROTEINANTEILS
67
3.1.4.3.
JE
LAENGER
EIN
SEKRETORISCHES
VORSTUFENPROTEIN
IST,
DESTO
EFFIZIENTER
KANN
ES
MIT
SRP
INTERAGIEREN
67
3
1.4
4.
EIN
ZWEIPHASIGER
KURVENVERLAUF
SPIEGELT
VIELLEICHT
IN
VIVO
VERHAELTNISSE
DER
REGULATION
DER
PROTEIN-SRP-WECHSELWIRKUNG
WIDER
69
3.1.4.5.
DIE
TEILNAHME
AM
RNP-ABHAENGIGEN
TRANSPORTWEG
BEDARF
EINER
EFFIZIENTEN
INTERAKTION
MIT
SRP
71
3.2.
IDENTIFIZIERUNG
VON
AM
TRANSPORT
SEKRETORISCHER
PROTEINE
INS
ENDOPLASMATISCHE
RETIKULUM
BETEILIGTEN
KOMPONENTEN
77
3.2.1.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
BISHER
NICHT
IDENTIFIZIERTER
PROTEINE
DES
TRANSLOKATIONSAPPARATES
IM
ENDOPLASMATISCHEN
RETIKULUM
77
3.2.2.
HOCHAUFLOESENDE
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
ALS
GRUNDLAGE
DER
UNTERSUCHUNG
FUNKTIONALER
UND
OPERATIONALER
KRITERIEN
VON
MIKROSOMALEN
PROTEINEN
78
3.2.2.1.
DIE
BETRACHTUNG
EINZELNER
PROTEINE
DURCH
ZWEI-DIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
78
3.2.2
2.
DIE
UNTERSUCHUNG
OPERATIONALER
UND
FUNKTIONALER
KRITERIEN
78
3.2.3.1.
DIE
AUFTRENNUNG
VON
MIKROSOMEN
UND
LIPOSOMEN
IN
ZWEI
DIMENSIONALEN
GELEN
FUHRT
ZU
REPRODUZIERBAREN
ERGEBNISSEN
81
3.2.3.2.
14C-NEM
UND
32P-AATP-MARKIERUNGEN
VON
MIK'ROSOMEN
FUEHRT
ZUR
SELEKTIVEN
DARSTELLUNG
EINER
BEGRENZTEN
ZAHL
VON PROTEINEN
92
3.2.3.3.
ATP-BINDENDE
PROTEINE
KOENNEN
MITTELS
EINER
ATP-SAEULE
VOM
SOLUBILISIERTEN
MIKROSOMENGESAMTPROTEIN
GETRENNT
WERDEN
101
3.2.4.
DIE
ANWENDUNG
DER
GEWAEHLTEN
OPERATIONALEN
UND
FUENKTIONALEN
KRITERIEN
IN
DER
2D-ELEKTROPHORESE
CHARAKTERISIERT
MOEGLICHERWEISE
PROTEINE
DES
TRANSPORTWEGES
103
3.2.4.1.
IDENTIFIZIERUNG
BEKANNTER
PROTEINE
IN
ID
UND
2D-GELEN
UND
EINFUEHRUNG
OPERATIONALEN
UND
FUENKTIONALEN
KRITERIEN
104
3.2.4.2.
ZUSAMMENFASSUNG
DER
BIOCHEMISCHEN
CHARAKTERISIERUNG
108
4.
DISKUSSION
111
4.1.1.
DIE
LAENGENABHAENGIGKEIT
DER
TRANSLATIONSEFFIZIENZ
111
4.1.2.
DIE
BEDINGUNGEN
DER
SRP-SIGNALSEQUENZ-INTERAKTION
112
4.2.1.
DAS
ARBEITSMODELL
DISKUTIERT
EINEN
SIGNALPEPTIDREZEPTOR
117
4.2.2.
UEBER
DIE
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
WERDEN
MOEGLICHERWEISE
AM
TRANSPORT
BETEILIGTE
PROTEINE
GEFUNDEN
120
4.3.
AUSBLICKE
126
5.
ZUSAMMENFASSUNG
127
6.
LITERATURVERZEICHNIS
128
DANKSAGUNG
137
LEBENSLAUF
139 |
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