Die Funktion der Spindel in Saccharomyces cerevisiae: Identifizierung und Charakterisierung neuer Gene mittels zellbiologischer und genetischer "Screening-Verfahren"
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1995
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1.
EINLEITUNG
.
5
1.1.
D
ER
S
PINDELAPPARAT
.
6
1.2.
D
IE
V
ERDOPPLUNG
UND
R
EGULATION
DES
S
PINDELPOLKOERPERS
.
7
1.3.
K
OMPONENTEN
DES
S
PINDELPOLKOERPERS
.
10
1.4.
F
UNKTIONEN
DES
S
PINDELPOLKOERPERS
.
12
1.5.
W
EITERE
K
OMPONENTEN
DER
MITOTISCHEN
S
PINDEL
.
13
1.6.
A
NWENDUNG
VON
YYS
CREENING
-V
ERFAHREN
"
.
14
2.
ERGEBNISSE
.
16
2.1.
YYS
CREENING
"
EINER
K
OLLEKTION
VON
TEMPERATURSENSITIVEN
M
UTANTEN
.
16
2.1.1.
G
RUNDLAGEN
DES
YYS
CREENING
-V
ERFAHRENS
"
.
16
2.1.2.
B
ESTIMMUNG
DES
DNA-G
EHALTS
DER
M
UTANTEN
.
16
2.1.3.
I
MMUNFLUORESZENZ
.
17
2.1.4.
R
UECKKREUZUNGEN
.
19
2.1.5.
T
EST
AUF
B
ENOMYLSENSITIVITAET
.
23
2.1.6.
E
RNEUTE
FACSC
AN
A
NALYSE
DER
RUECKGEKREUZTEN
TS
M
UTANTEN
.
25
2.1.7.
Z
USAMMENFASSUNG
ALLER
E
IGENSCHAFTEN
DER
AUSGEWAEHLTEN
M
UTANTEN
.
25
2.1.8.
C
HARAKTERISIERUNG
DER
M
UTANTE
II
528
.
27
2.1.9.
C
HARAKTERISIERUNG
DER
M
UTANTE
II
458
.
28
2.1.10.
C
HARAKTERISIERUNG
DER
M
UTANTE
II
261
.
30
2.1.10.1.
KOMPLEMENTATION
DES
TEMPERATURSENSITIVEN
PHAENOTYPS
.
30
2.1.1UE.2.
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSKLONEN
.
30
2.1.10.3.
SEQUENZANALYSE
.
31
2.1.10.4.
DISRUPTION
VON
ASM1
.
32
2.1.10.5.
ASML
IST
KEIN
SUPPRESSOR
DER
II
261
MUTATION
.
37
2.1.10.6.
SEQUENZHOMOLOGIEN
VON
ASML
ZU
ANDEREN
GENEN
.
38
2.1.10.7.
BESTIMMUNG
DER
ZUR
TEMPERATURSENSITIVITAET
FUEHRENDEN
MUTATION
IN
H
261
.
40
2.1.10.8.
PHAENOTYP
VON
ASML
"
.
40
2.1.10.9.
VITALFAERBUNG
DER
VAKUOLEN
IN
ASML
"
UND
ASMLA
.
41
2.1.10.10.
UEBEREXPRESSION
VON
ASM1
.
43
2.1.10.11.
SUCHE
NACH
MULTICOPY
SUPPRESSOREN
VON
ASML
"
.
45
2.1.10.12.
HERSTELLUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
.
47
2.1.10.13.
DETEKTION
VON
ASMLP
MIT
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
49
2.1.10.14.
ANHAENGEN
EINES
HAEMAGGLUTININ-YYTAGS
"
AN
ASMLP
.
49
2.1.10.15.
LOKALISATION
DER
YYGETAGGTEN
"
PROTEINE
MITTELS
IMMUNOELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
50
2.2.
YYS
CREENING
"
NACH
SYNTHETISCHER
L
ETALITAET
MIT
NUF1
"
.
52
2.2.1.
G
RUNDLAGEN
DES
YYS
CREENING
-V
ERFAHRENS
"
.
52
2.2.2.
K
ONSTRUKTION
DER
S
TAEMME
.
53
2.2.2.1.
KLONIERUNG
DES
NUF1
GENS
.
53
2.2.2.2.
DISRUPTION
VON
NUF1
.
53
2.2.2.3.
HERSTELLUNG
VON
TEMPERATURSENSITIVEN
NUFL
ALLELEN
.
57
2.2.3.
EMS-M
UTAGENESE
.
59
2.2.4.
KOMPLEMENTATION
POTENTIELL
SYNTHETISCH
LETALER
M
UTANTEN
.
61
2.2.5.
SL-K
ANDIDAT
IV-24
.
62
2.2.6.
L
OKALISATION
VON
N
UF
I
P
.
62
3.
DISKUSSION
.
65
3,1.
G
ENE
DES
YYS
CREENS
"
NACH
M
UTANTEN
MIT
VERAENDERTER
S
PINDELMORPHOLOGIE
.
65
3.1.1.
C
HARAKTERISIERUNG
DER
M
UTANTE
II
528
.
65
3.1.2.
C
HARAKTERISIERUNG
DER
M
UTANTE
II
458
.
66
3.1.3.
C
HARAKTERISIERUNG
DER
M
UTANTE
II
261
.
68
3.2.
G
ENE
DES
YYS
CREENS
NACH
SYNTHETISCHER
L
ETALITAET
"
MIT
NUF
I
"
_
71
3.2.1.
C
HARAKTERISIERUNG
DES
K
ANDIDATEN
IV-24
.
71
3.3.
N
EUE
E
RKENNTNISSE
ZUR
F
UNKTION
DES
S
PINDELPOLKOERPERS
.
71
3.4.
A
NWENDUNG
VON
YYS
CREENING
-V
ERFAHREN
"
ZUR
I
DENTIFIKATION
NEUER
S
PINDELPOLKOERPERKOMPONENTEN
.
73
4.
ZUSAMMENFASSUNG
.
76
5.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
77
5.1.
M
ATERIALIEN
.
77
5.1.1.
C
HEMIKALIEN
.
77
5.1.2.
R
ADIOAKTIVE
S
UBSTANZEN
.
77
5.1.3.
E
NZYME
.
77
5.1.4.
P
LASMIDE
.
78
5.1.5.
B
AKTERIENSTAEMME
.
79
5.1.6.
H
EFESTAEMME
.
79
5.1.7.
DNA-P
RIMER
.
80
5.1.8.
N
AEHRMEDIEN
.
81
5.1.8.1.
FESTE
MEDIEN
.
81
5.1.8.2.
FLUESSIGE
MEDIEN
.
82
5.1.9.
P
UFFER
.
82
5.2.
M
ETHODEN
.
85
5.2.1.
A
NZUCHT
VON
E.
COU
.
85
5.2.2.
I
SOLIERUNG
VON
DNA
AUS
PLASMIDHALTIGEN
E.
COU
-7
ELLW
.
85
5.2.2.1.
PLASMID-MINI-PRAEPARATIONEN
.
85
5.2.2.2.
PLASMID-MIDI-PRAEPARATIONEN
.
86
5.2.3.
P
HOTOMETRISCHE
K
ONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
.
86
5.2.4.
DNA
R
ESTRIKTIONSANALYSEN
.
86
5.2.5.
G
ELELEKTROPHORESE
.
86
5.2.5.1.
AGAROSEGELE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA
MOLEKUELEN
.
86
5.2.5.2.
LAENGENMARKER
BEI
DER
GELELEKTROPHORESE
.
87
5.2.6.
I
SOLIERUNG
VON
F
RAGMENTEN
AUS
A
GAROSEGELEN
.
87
5.2.7.
P
OLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
87
5.2.7.1.
PCR
MIT
PLASMID-DNA
.
87
5.2.7.2.
MUTAGENESE
MITTELS
PCR
.
87
5.2.8.
R
EINIGUNG
VON
DNA
P
RIMERN
.
88
5.2.9.
R
EINIGUNG
VON
PCR-P
RODUKTEN
.
88
5.2.10.
BEHANDLUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
.88
5.2.11.
L
IGATION
VON
DNA-F
RAGMENTEN
.
89
5.2.12.
T
RANSFORMATION
VON
B
AKTERIEN
.
89
5.2.12.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
DH5A
.
89
5.2.12.2.
ELEKTROPORATION
VON.
E.
COLI
.
89
'
5.2.12.3.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
SURE
ZELLEN
.
90
5.2.12.4.
TRANSFORMATION
VON
SURE
ZELLEN
.
90
5.2.13.
P-G
ALACTOSIDASE
T
ESTSYSTEM
.
90
5.2.14.
D
OPPELSTRANGSEQUENZIERUNG
.
91
5.2.15.
K
ONSTRUKTION
VON
D
ELETIONSMUTANTEN
UEBER
E
XONUKLEASE
IN
.
91
5.2.16.
E.
COU
G
LYCERINKULTUREN
.
92
5.2.17.
A
NZUCHT
VON
H
EFE
.
92
5.2.18.
Z
ELLZAHLBESTIMMUNG
.
92
5.2.19.
I
SOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
H
EFE
.
92
5.2.20.
S
OUTHERN
B
LOT
A
NALYSE
.
93
5.2.21.
T
RANSFORMATION
VON
H
EFE
.
93
5.2.21.1.
LITHIUMACETAT
TRANSFORMATION
.
93
5.2.21.2.
DMSO
TRANSFORMATION
.
93
5.2.21.3.
TRANSFORMATION
VON
GENBANKEN
.
94
5.2.21.4.
HERSTELLUNG
VON
CARRIER
DNA
.
94
5.2.22.
I
SOLIERUNG
VON
P
LASMID
-DNA
AUS
H
EFE
.
94
5.2.23.
R
UECKKREUZUNGEN
.
95
5.2.24.
S
PORENANALYSE
.
95
5.2.25.
F
ESTSTELLEN
DES
P
AARUNGSTYPS
.
95
5.2.26.
R
EPUKA
-
PLATTIERUNG
.
96
5.2.27.
H
EFE
-G
LYCERINKULTUREN
.
96
5.2.28.
IMMUNFLUORESZENZ
MIT
HEFEN
.
96
5.2.29.
B
ESTIMMUNG
DES
DNA-G
EHALTS
VON
H
EFEN
.
98
5.2.30.
BENOMYLSENSMVITAETSTEST
.
98
5.2.31.
EMS-M
UTAGENESE
.
98
5.2.32.
E
LEKTRONENMIKROSKOPIE
.
99
5.2.32.1.
EPONEINBETTUNG
.
99
5.2.32.2.
IMMUNOELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
99
5.2.33.
V
ITALFAERBUNG
VON
V
AKUOLENMEMBRANEN
.
100
5.2.34.
P
ROTEINEXTRAKTION
AUS
H
EFEN
.
100
5.2.35.
P
ROTEINMENGENBESTIMMUNG
.
100
5.2.35.1.
LOWRY-PROTEINBESTIMMUNG
.
100
5.2.35.2.
BRADFORD-PROTEINBESTIMMUNG
.
101
5.2.36.
P
ROTEIN
-P
OLYACRYLAMIDGELE
.
101
5.2.37.
W
ESTERN
-T
RANSFER
.
102
5.2.38.
H
ERSTELLUNG
VON
F
USIONSPROTEINEN
.
102
5.2.38.1.
EXPRESSION
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
IN
E.
COLI
.
102
5.2.38.2.
REINIGUNG
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
.
103
5.2.38.3.
EXPRESSION
VON
6X-HISTIDIN-FUSIONSPROTEINEN
IN
E.
COLI
.
103
5.2.38.4.
REINIGUNG
VON
6X-HIS-PROTEINEN
.
104
5.2.39.
P
RODUKTION
VON
A
NTIKOERPERN
.
104
5.2.39.1.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
.
104
5.2.39.2.
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPER
UEBER
NITROCELLULOSESTREIFEN
.
105
5.2.40.
C
OMPUTERANALYSE
.
105
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
106
7.
ABKUERZUNGEN
.115
8.
CURRICULUM
VITAE
.
117 |
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