Enzymkatalysierte Herstellung von Cytidinmonophosphat N-Acetylneuraminsäure mit einer Synthetase aus Escherichia coli (K 235-CS1):
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1994
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Datensatz im Suchindex
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS.I
LISTE DER ABBILDUNGEN.IV
LISTE DER TABELLEN.VIII
LISTE DER ABKUERZUNGEN UND DER SYMBOLE.X
1 EINLEITUNG.
1.1 KOHLENHYDRATE IN DER BIOTECHNOLOGIE
1.2 ENZYMATISCHE SYNTHESEN VON OLIGOSACCHARIDEN UND
AKTIVIERTEN ZUCKERN
1.3 SIALINSAEUREN: VORKOMMEN, BIOSYNTHESE, AKTIVIERUNG,
ANWENDUNG
2 PROBLEMATIK, FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG DER
DISSERTATION.
2.1 DAS ENZYM CMP-NEU5AC-SYNTHETASE
2.2 DAS ZIELPRODUKT CMP-NEU5AC
2.3 EIN ANWENDUNGSBEISPIEL: ENZYMATISCHER SIALINSAEURETRANSFER
3 GEWINNUNG DES ENZYMS CMP-NEU5AC-SYNTHETASE .
3.1 UEBERBLICK UEBER DIE ENZYMQUELLEN FUER DIE CMP-NEU5AC-
SYNTHETASE
3.2 DAS FAKULTATIV PATHOGENE BAKTERIUM E. COLI K235/CS1
3.3 GRUNDLAGEN BIOTECHNOLOGISCHER PROZESSE
3.4 FERMENTATIVE BIOMASSENGEWINNUNG
3.4.1 WACHSTUMSGEKOPPELTE ENZYMBILDUNG
3.4.2 ERNTE UND AUFSCHLUSS
3.4.3 UEBERPRUEFUNG DER NICHT UMGESETZTEN C-QUELLE: SORBIT
3.4.4 MESSDATENERFASSUNG
3.5 ERGEBNISSE DER FERMENTATIONEN VON E. COLI K235 UND
E. COLI 235/CS1
1
2
3
.8
8
10
11
12
12
13
16
17
19
21
21
24
25
4 AUFARBEITUNG DER CMP-NEU5AC-SYNTHETASE
,27
4.1 EINFUEHRUNG: AUFREINIGUNG VON PROTEINEN IM GROSSEN MASSSTAB
4.2 GRUNDLAGEN DER FLUESSIG-FLUESSIG-EXTRAKTION
4.2.1 CMP-NEU5AC-SYNTHETASE-EXTRAKTION MIT PEG(1550)-CITRAT
4.2.2 RUECKEXTRAKTION DER CMP-NEU5AC-SYNTHETASE
4.2.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHOSPHATASEN-ZUSAMMENSETZUNG IM
ZELLHOMOGENAT IN DER OBER- UND UNTERPHASE
4.3 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN
4.3.1 HIC: HYDROPHOBE INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
4.4 DIAFILTRATION DER CMP-NEU5AC-SYNTHETASE
4.5 ELEKTROPHORESE
4.6 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE
27
29
31
33
34
36
36
38
39
43
INHALTSVERZEICHNIS
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/946645248
UL UL
44
5 ENZYMATISCHE SYNTHESE VON CMP-NEU5AC
5.1
5.2
5.2.1
5.2.2
5.3
5.3.1
5.4
5.6
5.7
5.7.1
5.7.2
5.7.3
5.7.4
5.7.5
5.7.6
5.8
5.8.1
5.8.2
5.8.3
EINFUEHRUNG
CA
UNTERSUCHUNGEN ZUR SYNTHESEREAKTION DER CMP-NEU5AC
SYNTHETASE: EINFLUSS VON ME (II), PH-OPTIMA, TEMPERATUR
CMP-NEU5AC-SYNTHETASE: SUBSTRATSPEKTRUM
KINETIK ENZYMKATALYSIERTER REAKTIONEN
REAKTIONSKINETIK DER CMP-NEU5AC-SYNTHETASE
UNTERSUCHUNGEN ZUR RUECKREAKTION
KOPPLUNG MIT EINER NACHFOLGENDEN REAKTION
CHEMISCHE HYDROLYSE VON CMP-NEU5AC
ERGEBNISSE DER KINETISCHEN UNTERSUCHUNGEN
KONTINUIERLICHE PRODUKTION VON CMP-NEU5AC IM
ENZYM-MEMBRAN-REAKTOR (EMR)
EINFUEHRUNG
MODELLRECHNUNGEN ZUR ERMITTLUNG OPTIMALER BEDINGUNGEN
MODELLIERUNG DER KONTINUIERLICHEN VERSUCHE:
DURCHFUEHRUNG DER BERECHNUNGEN
KONTINUIERLICHER EINSATZ DER CMP-NEU5AC-SYNTHETASE
IM EMR
KONTINUIERLICHE PH-REGELUNG
ERGEBNISSE DER VERSUCHE ZUR KONTINUIERLICHEN CMP-NEU5AC-
PRODUKTION IM EMR
CMP-NEU5AC-PRODUKTION IM SATZREAKTOR
NACHBEHANDLUNG DER REAKTIONSMISCHUNG MIT ALKALISCHER
PHOSPHATASE
ERGEBNISSE DER SATZREAKTORVERSUCHE
VERGLEICH VON SATZREAKTOREN UND KONTINUIERLICH
DURCHGEFUEHRTEN VERSUCHEN
44
45
45
47
50
51
54
55
58
60
65
65
66
69
74
75
78
80
81
84
88
6 METHODEN ZUR ISOLIERUNG VON CMP-NEU5AC
90
6.1 EINFUEHRUNG
6.2 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN ZUR GEWINNUNG
VON CMP-NEU5AC
6.2.1 TRENNUNG VON NUCLEOTIDEN
6.2.2 GELFILTRATION
6.2.3 ABTRENNUNG DES FORMIATS MITTELS UMKEHROSMOSE
6.3 NMR-DATEN VON CMP-NEU5AC
6.4 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE
91
91
91
92
93
94
96
INHALTSVERZEICHNIS
7 EIN ANWENDUNGSBEISPIEL:
ENZYMATISCHER SIALINSAEURETRANSFER.97
7.1 TRISACCHARIDE ALS TARGETMOIEKUELE 97
7.2 DAS ENZYM A-(2-3)-SIALYLTRANSFERASE AUS SCHWEINELEBER 98
7.2.1 WAESSRIGE ZWEIPHASENSYSTEME 101
7.2.2 ELEKTROPHORESE ZUR UEBERPRUEFUNG DER REINHEIT
DER A-(2-3)- SIALYLTRANSFERASE 104
7.3 ANWENDUNG DER AUFGEREINIGTEN A-(2-3)- SIALYLTRANSFERASE 106
8 ZUSAMMENFASSUNG.107
8.1 DAS ENZYM CMP-NEU5AC-SYNTHETASE 107
8.2 DAS PRODUKT CMP-NEU5AC 108
8.3 DAS BEISPIEL: SIALINSAEURETRANSFER MITTELS EINER TRANSFERASE 110
9 AUSBLICK.111
10 MATERIALIEN UND METHODEN.113
10.1 FERMENTATION VON E. COLI K235 113
10.2 PROTEINBESTIMMUNGEN 116
10.2.1 BCA-METHODE 116
10.2.2 BRADFORD-METHODE 118
10.3 ENZYMATISCHE AUFREINIGUNGSMETHODEN 118
10.3.1 AUFREINIGUNG DER CMP-NEU5AC-SYNTHETASE 118
10.3.2 AUFREINIGUNG DER A-(2-3)-SIALYLTRANSFERASE
AUS SCHWEINELEBER 120
10.4 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 123
10.4.1 AKTIVIERUNG DES GELS CDP-HEXANOLAMINAGAROSE 123
10.4.2 AKTIVIERUNG DES GELS CIBACRON-BLUE AGAROSE 123
10.5 ENZYMATISCHE BESTIMMUNGEN 125
10.5.1 CMP-NEU5AC-SYNTHETASE-AKTIVITAET 125
10.5.2 A-(2-3)SIALYLTRANSFERASE-AKTIVITAET 125
10.5.3 PHOSPHATASE-AKTIVITAET 126
10.5.4 ENZYMATISCHE BESTIMMUNG VON PYROPHOSPHAT 126
10.6 DISK-ELEKTROPHORESE 127
10.7 HPLC-BESTIMMUNGEN 129
10.8 ISOLIERUNG VON CMP-NEU5AC 130
10.8.1 CHROMATOGRAPHISCHE VORSCHRIFTEN 130
11 LITERATURLISTE.132
ANHANG.141
LEBENSLAUF
141
INHALTSVERZEICHNIS
III |
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