Struktur, Stoffwechsel und Funktion von Proteoglykan-100:
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1995
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I
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. EINLEITUNG 1
1.1 STRUKTUR UND KLASSIFIZIERUNG DER PROTEOGLYKANE 1
1.2 STRUKTUR UND EIGENSCHAFTEN VON PROTEOGLYKAN-100 6
1.3 BEZIEHUNGEN ZWISCHEN CYTOKINEN UND PROTEOGLYKANEN 8
1.4 FUNKTION UND STRUKTUR DES
MAKROPHAGEN-KOLONIE-STIMULIERENDEN FAKTORS
11
1.5 PROBLEMSTELLUNG
16
2. ERGEBNISSE 17
2.1 VORKOMMEN VON PG-100 IN ZELLKULTUREN MENSCHLICHER
OSTEOSARKOM-ZELLEN UND HAUTFIBROBLASTEN
17
2.1.1 NACHWEIS EINES BISHER UNBEKANNTEN PROTEOGLYKANS 17
2.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER GLYKOSAMINOGLYKAN-KETTEN VON PG-100 19
2.2 PRAEPARATIVE REINIGUNG VON PG-100 20
2.3 ISOLIERUNG PROTEOLYTISCHER SPALTPRODUKTE
DES PG-100-CORE-PROTEINS 24
2.4 PARTIELLE AMINOSAEURE-SEQUENZANALYSE
DES PG-100-CORE-PROTEINS 27
2.4.1 N-TERMINALE SEQUENZIERUNG DES PG-100-CORE-PROTEINS 27
2.4.2 SEQUENZIERUNG VON PEPTID 1 27
2.4.3 SEQUENZIERUNG VON PEPTID 2 28
2.4.4 PRIMAERSTRUKTUREN SEQUENZIERTER CORE-PROTEIN-PEPTIDE 29
2.4.5 VERGLEICH DER AMINOSAEURE-SEQUENZEN VON PG-100 MIT DER
PRIMAERSTRUKTUR DES MAKROPHAGEN-KOLONIE-STIMULIERENDEN FAKTORS 30
2.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR KREUZREAKTIVITAET VON PG-100- UND
CSF-1-ANTISEREN
32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
2.5.1
2.5.2
2.53
2.5.4
2.6
2
.
6.1
2
.
6.2
2
.
6
.
2.1
2.6.3
2.7
2.8
2.9
2.9.1
2.9.2
2.10
2.11
2.12
2.13
2.14
2.15
2.15.1
IMMUNPRAEZIPITATION VON PG-100 UND CSF-1 AUS MG-63-SEKRETEN
IMMUNPRAEZIPITATION VON PG-100 UND CSF-1 AUS L929-SEKRETEN
VERGLEICH DER PG-100-LMMUNPRAEZIPITATE AUS MG-63- UND
L929-SEKRETEN
WESTEM-BLOT-ANALYSE DER KREUZREAKTIVITAETEN VON PG-100- UND
CSF-1-ANTISEREN
NACHWEIS UND KLONIERUNG VON
PG
-1
OO-CORE-PROTEIN-SPEZIFISCHER CDNA
POLYMERASE-KETTENREAKTION MIT DEGENERIERTEN PRIMERN
POLYMERASE-KETTENREAKTION MIT SPEZIFISCHEN PRIMERN
SUBKLONIERUNG EINES PSTL/BAMHI-CDNA FRAGMENTS
AUS PGEM-T/1350 BP
POLYMERASE-KETTENREAKTION MIT SPEZIFISCHEM UND
DEGENERIERTEM PRIMER
NACHWEIS UND KLONIERUNG VON CSF-1 -SPEZIFISCHER CDNA
SEQUENZIERUNG VON PG-100-CORE-PROTEIN- UND CSF-1-CDNA
NORTHEM-BLOT-ANALYSE VON PG-100/CSF-1-TRANSKRIPTEN
IDENTIFIKATION VON PG-100/CSF-1-MRNA IN MG-63-ZELLEN
IDENTIFIKATION VON PG-100/CSF-1-MRNA IN VERSCHIEDENEN
EUKARYONTISCHEN ZELLINIEN
SOUTHEM-BLOT-ANALYSE GENOMISCHER DNA
EINFLUSS VON TGF-SS AUF DIE BIOSYNTHESE VON PG-100
32
34
35
36
37
38
39
41
42
42
43
46
46
47
48
49
EINFLUSS DER TNF-A-KONZENTRATION AUF DIE BIOSYNTHESE VON
PG-100
50
UNTERSUCHUNG DER FUNKTION VON PG-1 OO-CHONDROITINSULFAT-KETTEN 52
PROTEOLYSE DES PG-100-CORE-PROTEINS
UNTERSUCHUNG DER MAKROPHAGEN-KOLONIE-STIMULIERENDEN AKTIVITAET
VON PG-100
UNTERSUCHUNG DER PROLIFERATIONS-AKTIVITAET VON KONDITIONIERTEM
MG-63-MEDIUM UND VON MG-63-PROTEOGLYKANEN
53
55
55
III
2.15.2
2.15.3
2.15.4
2.15.5
2.15.6
2.15.7
2.15.8
2.16
2.16.1
2.16.2
PROLIFERATION VON KNOCHENMARKZELLEN DURCH PG-100
UNTERSUCHUNG DER KOLONIE-BILDENDEN AKTIVITAET VON PG-100
INHIBITION DER PROLIFERATIVEN AKTIVITAET VON PG-100
IDENTIFIZIERUNG MAKROPHAGEN-SPEZIFISCHER OBERFLAECHENANTIGENE
NACH STIMULATION VON KNOCHENMARKZELLEN MIT PG-100
ANTIGENPRAESENTATION VON PG-100-KULTIVIERTEN MAKROPHAGEN
PROLIFERATIVE EIGENSCHAFTEN DES PG-1OE0-CORE-PROTEINS
PROLIFERATIVE EIGENSCHAFTEN EINES PG-100-CORE-PROTEIN
FRAGMENTS
IMMUNOHISTOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON PG-100
CHARAKTERISIERUNG VON PG-100 IN ZIRRHOTISCHER LEBER
CHARAKTERISIERUNG VON PG-100 IN HETEROTOPER OSSIFIKATION
57
59
61
63
63
65
66
68
68
70
3. DISKUSSION
3.1 IDENTITAET VON PG-100 MIT CSF-1
3.2 STRUKTUR VON PG-100/CSF-1
3.3 REGULATION DER EXPRESSION VON PG-100/CSF-1
3.4 FUNKTIONELLE BEDEUTUNG DER PG-100/CSF-1-
CHONDROITINSULFAT-KETTE
3.5 FUNKTION VON PG-100/CSF-1
4. ZUSAMMENFASSUNG
72
72
81
85
86
87
91
5. MATERIAL UND METHODEN
93
5.1 ARBEITEN MIT ZELLKULTUREN
5.1.1 KULTIVIERUNG EUKARYONTISCHER ZELLEN
5.1.2 ISOLIERUNG UNMARKIERTER PROTEOGLYKANE
5.1.3 METABOLISCHE MARKIERUNGEN KULTIVIERTER ZELLEN
93
93
95
96
5.2 TRENNMETHODEN
5.2.1 LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
5.2.1.1 ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN DEAE-TRISACRYL M
5.2.1.2
5.2.2
5.2.3
5.2.4
5.2.5
5.2.6
5.2.7
5.2.7.1
5.2.7.2
52.7.3
5.2.8
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.5
5.5.1
5.5.2
5.6
5.6.1
5.6.2
5.7
5.8
5.8.1
5.8.2
5.8.3
IV
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE AN BIOGEL-TSK-DEAE-5PW
CHROMATOGRAPHIE VON DISACCHARIDEN AN PARTISIL-PAC
JACALIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
REVERSED-PHASE-HPLC
ULTRAFILTRATION
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
EINFACHE UND PRAEPARATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
NORTHEM-GELELEKTROPHORESE
SOUTHEM-GELELEKTROPHORESE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG
EINZELSTRAENGIGER DNA
97
98
98
99
100
100
101
101
102
103
104
IMMUNOLOGISCHE METHODEN 105
ERZEUGUNG EINES PG-100-ANTISERUMS 105
REINIGUNG VON PG-100-ANTIKOERPEM DURCH
PG-100-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 105
REINIGUNG VON PG-100 DURCH
ANTIKOERPER-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 106
IMMUNPRAEZIPITATION 107
NACHWEISMETHODEN 108
BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTS 108
WESTEM-BLOTTING UND DETEKTION GEBUNDENER ANTIKOERPER 109
NORTHEM-BLOTTING UND HYBRIDISIERUNG 110
SOUTHEM-BLOTTING UND HYBRIDISIERUNG 111
ISOLIERUNG VON DNA 111
ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA 111
ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 112
ISOLIERUNG VON RNA 113
ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 113
ISOLIERUNG VON MRNA 113
ISOLIERUNG EINES PG
100
-CORE-PROTEIN FRAGMENTS
114
ENZYMATISCHE REAKTIONEN 114
ABBAU MIT CHONDROITIN-ABC-LYASE 114
ABBAU MIT CHONDROITIN-AC IL-LYASE 115
ABBAU MIT ENDOGLYKOSIDASE F
116
V
5.8.4
5.8.5
5.8.6
5.8.7
5.8.8
5.8.9
5.9
5.9.1
5.9.2
5.9.3
5.10
5.11
5.12
5.13
5.14
5.15
5.16
5.17
5.18
5.18.1
5.18.2
6
.
ABBAU MIT ENDOPROTEINASE ASP-N
SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
ABBAU VON AGAROSEN MIT GELASE
YY
SEQUENZIERUNG DOPPELSTRAENGIGER DNA MIT
VENTR
YY
(EXO") DNA-POLYMERASE
DNA-AMPLIFIKATION MIT DER THERMOSTABILEN DNA-POLYMERASE
REPLITHERM
YY
REVERSE TRANSKRIPTION MIT M-MULV REVERSER TRANSKRIPTASE
KLONIERUNG VON DNA
LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN
HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN NACH DER CACI
2-METHODE
TRANSFORMATION VON REKOMBINANTER PLASMID-DNA
RADIOAKTIVE DNA-MARKIERUNG
SYNTHESE UND REINIGUNG VON OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDEN
SEQUENZIERUNG VON PROTEINEN UND PEPTIDEN
116
116
117
117
118
119
120
120
120
121
121
122
122
UNTERSUCHUNG DER MAKROPHAGEN-KOLONIE-STIMULIERENDEN AKTIVITAET
122
NACHWEIS MAKROPHAGEN-SPEZIFISCHER OBERFLAECHENANTIGENE
UNTERSUCHUNG DER T-ZELL-PROLIFERATION
FLUOROGRAPHIE UND AUTORADIOGRAPHIE
PRAEPARATION VON PG-100 (UEBERSICHT)
123
124
124
125
GERAETE UND MATERIALIEN
GERAETE
MATERIALIEN
126
126
126
LITERATURVERZEICHNIS
129 |
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