Isolierung und Charakterisierung von Laccasen und Peroxidasen aus Basidiomyceten der Ordnung Agaricales:
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1995
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adam_text | 6 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON LACCASEN UND PEROXIDASEN AUS
BASIDIOMYCETEN DER ORDNUNG AGARICALES VOM FACHBEREICH BIOLOGIE DER
UNIVERSITAET KAISERSLAUTERN ZUR VERLEIHUNG DES AKADEMISCHEN GRADES
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN GENEHMIGTE DISSERTATION (D 386)
VORGELEGT VON MARION HEINZKILL VORSITZENDER: 1. BERICHTERSTATTER: 2.
BERICHTERSTATTER: PROF. DR. H. HUBER PROF. DR. T. ANKE PROF. DR. J.
CULLUM TAG DER WISSENSCHAFTLICHEN AUSSPRACHE 14. DEZEMBER 1995
KAISERSLAUTERN 1995 INHALT 1 EINLEITUNG 2 DAS LIGNINOLYTISCHE SYSTEM DER
PILZE 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 HOLZ ALS SUBSTRAT FUER PILZE LIGNINOLYTISCHE
ENZYME REGULATION LIGNINOLYTISCHER ENZYME LOKALISATION
LIGNOCEHULYTISCHER ENZYME BEI WEISSFAEULE BEKANNTE LACCASE- UND
PEROXIDASE-PRODUZENTEN 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3
3.3 3.4 3.5 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 3.6.4.1 3.6.4.2 3.6.4.3 3.6.4.4
3.6.5 3.6.6 3.7 3.7.1 3.7.1.1 3.7.1.2 CHEMIKALIEN NAEHRMEDIEN, PUFFER UND
LOESUNGEN ZUSAMMENSETZUNG DER KOMPLEXEN MEDIENBESTANDTEILE LAUT
HERSTELLERANGABE ZUSAMMENSETZUNG DER VERWENDETEN MEDIEN PUFFER UND
LOESUNGEN BASIDIOMYCETEN AUS DER STAMMSAMMLUNG BEARBEITETE PILZSTAEMME
BASIDIOMYCETEN ALS VERGLEICHSORGANISMEN FERMENTATION DER
BASIDIOMYCETENSTAEMME GEWINNUNG DER KULTURFILTRATE FUER DAS SCREENING
NAEHRMEDIENVERSUCHE FERMENTATION DER PRODUZENTENSTAEMME
FERMENTATIONSANALYSEN GLUKOSE- UND MALTOSEBESTIMMUNG PH-WERT
FESTSTOFFGEHALT ABGASANALYTIK INDUKTION DER ENZYMAKTIVITAETEN
STANDKULTUREN DER BEARBEITETEN BASIDIOMYCETENSTAEMME ZUM NACHWEIS
MYCELGEBUNDENER LIGNINOLYTISCHER ENZYME SCREENING NACH LACCASEN UND
PEROXIDASEN ENZYMATISCHE TESTSYSTEME ABTS-ASSAY 4-AA + TOPS-ASSAY SEITE
1 5 5 6 9 10 12 15 15 17 17 17 21 22 24 25 25 25 26 26 27 27 28 28 28 29
30 30 31 31 33 3.7.2 NACHWEIS LIGNINOLYTISCHER ENZYME IN FESTMEDIEN 34
3.7.2.1 WA-AGAR-ASSAY 34 3.7.2.2 GUAIACOL-SPOT-TEST 34 3.7.3
DBL-ASSAYINMIKROTITERPLATTEN 34 3.7.4 HITZESTABILITAET VON LACCASEN 35
3.7.5 NATIVE PAGE ZUR DETEKTION VON LACCASEN UND PEROXIDASEN 35 3.7.6
SCHNELL-SCREENING 36 3.8 WEITERE ENZYMTESTS ZUM NACHWEIS
LIGNINOLYTISCHER ENZYME 36 3.8.1 SYRINGALDAZIN-ASSAY 36 3.8.2
VERATRYLALKOHOL-ASSAY 37 3.8.3 PYROGALLOL-ASSAY 37 3.8.4 NADH-ASSAY 37
3.8.5 MN/LACTAT-ASSAY 38 3.8.6 2,6-DMP-ASSAY 38 3.8.7 PHENOLROT-ASSAY 39
3.9 WEITERE TESTS AUF FESTMEDIEN ZUM NACHWEIS LIGNINOLYTISCHER ENZYME 40
3.9.1 MNP-AGAR-ASSAY 40 3.9.2 3-NA-ASSAY 40 3.10 OXIDATION VON
FARBSTOFFEN 41 3.10.1 AGARTEST MIT VERSCHIEDENEN FARBSTOFFEN 41 3.10.2
BESTIMMUNG DES REDOXPOTENTIALS DER FARBSTOFFE 42 3.11 BESTIMMUNG DER
PROTEASE-UND KATALASE-AKTIVITAET 43 3.12 AGARDIFFUSIONSTEST 44 3.13
METHODEN ZUR REINIGUNG UND PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN CHARAKTERISIERUNG DER
ENZYME 44 3.13.1 SAEULENCHROMATOGRAPHIE 44 3.13.2 PROTEINBESTIMMUNG 45
3.13.3 DIALYSE 45 3.13.4 ULTRAFILTRATION 45 3.13.5
POLYACRYLAMID-GELEKTROPHORESE 46 3.13.6 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG 46
3.13.7 BESTIMMUNG DER IONENSTAERKE MIT HILFE DER LEITFAEHIGKEIT 47 3.13.8
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG 47 3.13.9 N-TERMINALE SEQUENZANALYSE 47
3.13.10 SPEKTROSKOPIE 48 3.14 METHODEN ZUR BIOLOGISCHEN
CHARAKTERISIERUNG DER ENZYME 48 3.14.1 BESTIMMUNG DES K M -WERTES 48
3.14.2 BESTIMMUNG DES K R WERTES 48 3.14.3 BESTIMMUNG DES
TEMPERATUROPTIMUMS UND DER STABILITAET 49 3.14.4 BESTIMMUNG DES
PH-OPTIMUMS 49 3.14.5 BESTIMMUNG DES SUBSTRATSPEKTRUMS 49 ERGEBNISSE 50
4.1 SCREENING UND AUSWAHL DER PRODUZENTENSTAEMME 50 4.2 WEITERE
ENZYMTESTS ZUM NACHWEIS LIGNINOLYTISCHER ENZYME 58 4.3 WEITERE TETS AUF
FESTMEDIEN ZUM NACHWEIS LIGNINOLYTISCHER ENZYME 60 4.4 EINFLUSS DES
NAEHRMEDIUMS AUF DIE ENZYMAKTIVITAET 63 4.5 STANDKULTUREN DER BEARBEITETEN
BASIDIOMYCETENSTAEMME ZUM NACHWEIS MYCELGEBUNDENER LIGNINOLYTISCHER
ENZYME 65 4.6 BESTIMMUNG DER PROTEASE- UND KATALASE-AKTIVITAET IM
KULTURFILTRAT DER BEARBEITETEN BASIDIOMYCETENSTAEMME 66 4.7 BEARBEITETE
PILZE UND DIE AUS IHNEN ISOLIERTEN ENZYME 66 4.7.1 ISOLIERUNG EINER
LACCASE UND MANGAN-PEROXIDASE AUS PANAEOLUS SPHINCTRINUS 82066 66
4.7.1.1 PRODUKTIONSSTAMM PANAEOLUS SPHINCTRINUS 82066 66 4.7.1.3
REINIGUNG DER LACCASE AUS PANAEOLUS SPHINCTRINUS 82066 69 4.7.1.4
REINIGUNG DER MANGAN-PEROXIDASE AUS PANAEOLUS SPHINCTRINUS 82066 72
4.7.1.5 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER LACCASE AUS PANAEOLUS
SPHINCTRINUS 82066 76 4.7.1.6 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
MANGAN-PEROXIDASE AUS PANAEOLUS SPHINCTRINUS 82066 79 4.7.2 ISOLIERUNG
EINER LACCASE AUS PANAEOLUS PAPILIONACEUS 85042 84 4.7.2.1
PRODUKTIONSSTAMM PANAEOLUS PAPILIONACEUS 85042 84 4.7.2.2 FERMENTATION
VON PANAEOLUS PAPILIONACEUS 85042 84 4.7.2.3 REINIGUNG DER LACCASE AUS
PANAEOLUS PAPILIONACEUS 85042 87 4.7.2.4 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG
DER LACCASE AUS PANAEOLUS PAPILIONACEUS 85042 89 4.7.3 ISOLIERUNG EINER
LACCASE AUS COPRINUS FRIESII 92 4.7.3.1 DER PRODUZENTENSTAMM COPRINUS
FRIESII 92 4.7.3.2 FERMENTATION VON COPRINUS FRIESII 92 4.7.3.3
REINIGUNG DER LACCASE AUS COPRINUS FRIESII 96 4.7.3.4 REINIGUNG ZWEIER
PEROXIDASEN AUS COPRINUS FRIESII 99 4.7.3.5 BIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG DER LACCASE AUS COPRINUS FRIESII 103 4.7.3.6
BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PEROXIDASE I AUS COPRINUS FRIESII 106
4.7.3.7 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PEROXIDASE II AUS COPRINUS
FRIESII 109 4.7.4 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER VERGLEICHSENZYME 112
4.7.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER LACCASE AUS POLYPORUSPINSITUS 113 4.7.4.2
CHARAKTERISIERUNG DER PEROXIDASE AUS COPRINUS CINEREUS 116 4.7.4.3
CHARAKTERISIERUNG DER MANGAN-PEROXIDASE AUS PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
119 4.7.5 PHYSIKALISCH-CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER GEREINIGTEN
ENZYME 4.7.5.1 4.7.5.2 4.7.5.3 4.7.5.4 4.8 4.8.1 4.9 4.9.1 4.9.2 4.10
DISKUSSION 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 5.4 EINSCHLIESSLICH
DER ENZYMSTANDARDS UV/VIS-SPEKTREN SDS-PAGE, NATIVE PAGE UND
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG DER GEREINIGTEN ENZYME ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZEN INDUKTION DER
ENZYMAKTIVITAETEN DER BEARBEITETEN BASIDIOMYCETENSTAEMME INDUKTION DER
LACCASE-AKTIVITAET VON COPRINUS FRIESII OXIDATION VON FARBSTOFFEN
AGARTEST MIT VERSCHIEDENEN FARBSTOFFEN REDOXPOTENTIALE DER FARBSTOFFE
AGARDIFFUSIONSTEST SCREENING NACH LACCASEN UND PEROXIDASEN BEKANNTE
SCREENINGMETHODEN VERWENDETE SCREENINGTESTS ERGEBNISSE DES SCREENINGS
ZUSAETZLICHE ENZYMTESTS ZUR DETEKTION LIGNINOLYTISCHER ENZYME DER
AUSGEWAEHLTEN BASIDIOMYCETENSTAEMME FERMENTATION DER BASIDIOMYCETENSTAEMME
NAEHRMEDIENVERSUCHE FERMENTATION DER BEARBEITETEN BASIDIOMYCETENSTAEMME IM
201 MASSSTAB REINIGUNG DER LACCASEN UND PEROXIDASEN 123 123 128 131 132
132 133 136 136 141 142 143 143 143 144 145 146 147 147 148 149 5.5
CHARAKTERISIERUNG DER GEREINIGTEN ENZYME UND VERGLEICHSENZYME 149 5.6
CHEMISCH-PHYSIKALISCHE CHARAKTERISIERUNG DER LACCASEN UND PEROXIDASEN
153 5.6.1 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG 153 5.6.2 ISOENZYME VON LACCASEN
UND PEROXIDASEN 153 5.6.3 N-TERMINALE AMINOSAEURESEQUENZEN 154 5.6.4
STRUKTUREN BEKANNTER LACCASEN UND PEROXIDASEN 156 5.7 INDUKTION DER
ENZYMAKTIVITAETEN 157 5.8 OXIDATION VON FARBSTOFFEN DURCH PILZE 158 5.9
PRODUKTION VON ANTIBIOTIKA 162 5.10 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON
LACCASEN UND PEROXIDASEN BEI PILZEN 162 5.11 AUSBLICK 163 6
ZUSAMMENFASSUNG 165 7 LITERATUR 166
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