Verfügbarkeit: Entwicklung und Anwendung sensitiver in-situ-Techniken zum Nachweis ribosomaler RNS in ganzen bakteriellen Zellen

Entwicklung und Anwendung sensitiver in-situ-Techniken zum Nachweis ribosomaler RNS in ganzen bakteriellen Zellen:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Trebesius, Karlheinz (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	1995
Schlagworte:	Nachweis Bakterien In situ Ribosomale RNS Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	VIII, 138 S. Ill., graph. Darst.

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS A EINLEITUNG _ 1 B MATERIAL UND METHODEN _ 10 B.L V ERWENDETE M IKROORGANISMEN . 10 B.2 N AEHRMEDIEN , Z USATZSTOFFE , A NZUCHT , S TAMMHALTUNG UND Z ELLERNTE . 11 B.2.1 NAEHRMEDIEN . 11 B.2. 2 ZUSATZSTOFFE . 12 B.2. 3 BAKTERIENANZUCHT . 13 B.2.4 STAMMHALTUNG . 13 B.2.5 ZELLEMTE . 13 B.3 Z ELLFIXIERUNGEN . 13 B.3.1 PARAFORMALDEYDFIXIERUNG . 13 B.3.2 ETHANOLFIXIERUNG . 14 B.3. 3 ETHANOL-ESSIGSAEUREFIXIERUNG . 14 B.3. 4 METHANOL-ACETONFIXIERUNG . 14 B.4 K LONIERUNG VON RRNS G ENEN AUS K LAERSCHLAMM . 15 B.4.1 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEURE . 15 B.4.1.1 NUKLEINSAEUREISOLIERUNG NACH STAHL UND FLESHER (1987, MODIFIZIERT) . 15 B.4.1.2 SCHNELLISOLIERUNG VON DNS (MODIFIZIERT NACH LEWINGTON ET AL., 1987) . 16 B.4.2 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG . 17 B.4.3 IN VITRO AMPLIFIKATION VON RRNS-GENEN (RDNS) DURCH DIE POLYMERASE-KETTEN REAKTION (PCR; EHRLICH ET AL., 1988) . 18 B.4.4 ISOLIERUNG, REINIGUNG UND AUF KONZENTRIERUNG VON PCR-PRODUKTEN UND ANDEREN DNS-FRAGMENTEN . 22 B.4.5 MODIFIKATION VON DNS DURCH ENZYME . 22 B.4.5.1 SPALTUNG VON DNS MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN (ZABEAU UND ROBERTS, 1979) . 22 B.4.5.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNS-MOLEKUELEN MIT AP . 23 B.4.5. 3 VERKNUEPFUNG VON DNS-MOLEKUELEN MIT T4-DNS-LIGASE . 23 B.4.6 TRANSFORMATION VON E.COLI . 24 B.4.6.1 CACH-METHODE (NACH COHEN ET AL., 1972) . 24 B.4.6.2 ELEKTROPORATION (NACH AUSUBEL ET AL., 1987) . 25 B.4. 7 PLASMIDISOLIERUNG . 26 B.4.7.1 PLASMIDISOLIERUNG FUER DIE IN VITRO TRANSKRIPTION . 26 B.4.7. 1.1 PLASMIDISOLIERUNG MITTELS SAEULENCHROMATOGRAPHIE . 26 B.4.7.1.2 PHENOLEXTRAKTION DER PLASMIDE . 26 B.4.7.2 PLASMIDISOLIERUNG (NACH HOLMES UND QUIGLEY, 1981) . 27 B.4.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE . 28 B.5 M ARKIERUNG VON N UKLEINSAEUREN . 29 B.5.1 CHEMISCHE MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN . 29 B.5. 1.1 ENTWICKLUNG VON RRNS-GERICHTETEN OLIGONUKLEOTIDSONDEN . 29 B.5. 1.2 MARKIERUNG DER OLIGONUKLEOTIDE . 29 B.5. 1.2.1 MARKIERUNG MIT FLUORESZENZFARBSTOFFEN . 30 I NHALTSVERZEICHNIS B.5.1 .2.2 ABTRENNUNG DES NICHT UMGESETZTEN FARBSTOFFS . 30 B. 5.1.2.3 ABTRENNUNG DES UNMARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDANTEILS . 31 B.5.1. 2.4 ABTRENNUNG VON SALZEN . 32 B.5. 1.2.5 PHOTOMETRISCHE VERMESSUNG DER MARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDE . 33 B.5.1. 3 MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN MIT DIG . 34 B.5.1. 4 MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN MIT POD . 34 B.5.2 MARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN DURCH TDT-VERLAENGERUNG. 34 B.5.2.1 PRINZIP . 34 B.5.2.2 MARKIERUNG DER OLIGONUKLEOTIDE MIT TERMINALER TRANSFERASE . 34 B.5.2.3 UEBERPRUEFUNG DER TDT-VERLAENGERUNGSREAKTION MIT PAGE . 36 B.5.2.4 SILBERFAERBUNG DES PAA-GELS . 37 B.5.3 MARKIERUNG VON POLYNUKLEOTIDEN DURCH RNS-POLYMERASEN . 38 B.5.3.1 PRINZIP . 38 B.5.3.2 MARKIERTE UTPS . ? . 39 B.5.3.3 IN VITRO TRANSKRIPTION . 40 B.5.3.4 PHOTOMETRISCHE VERMESSUNG MARKIERTER POLYNUKLEOTIDSONDEN . 42 B.5.3.4.1 PHYSIKALISCHE KONSTANTEN VON NUKLEOTIDEN . 42 B.5.3.4.2 MOLAREN KONZENTRATION VON NUKLEOTIDEN UND FARBSTOFFEN . 42 B.5.3.4.3 UEBERPRUEFUNG DER TRANSKRIPTLAENGE DURCH PAGE . 43 B.6 H YBRIDISIERUNGEN . 44 B.6.1 ABSCHAETZUNG DER HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN . 44 B.6. 2 HYBRIDISIERUNG MEMBRANGEBUNDENER NUKLEINSAEUREN (DOT-BLOT-HYBRIDISIERUNG). 45 B.6.2.1 DENATURIERUNG DER NUKLEINSAEURE UND MEMBRANTRANSFER . 45 B.6.2.2 HYBRIDISIERUNG IMMOBILISIERTER NUKLEINSAEUREN MIT POD-MARKIERTEN OLIGONU KLEOTIDEN UND CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS . 46 B.6.2.3 HYBRIDISIERUNG IMMOBILISIERTER NUKLEINSAEUREN MIT FLUOS UND DIG MARKIERTEN POLYNUKLEOTIDEN (KOMPETITIVE HYBRIDISIERUNG) . 48 B.6.2.3. 1 PRINZIP . 48 B.6.2.3.2 DURCHFUEHRUNG DER KOMPETITIVEN HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION DER SONDEN . 49 B.6.3 IN SITU EINZELZELL-HYBRIDISIERUNG . 52 B.6.3.1 BESCHICHTUNG DER OBJEKTTRAEGER MIT GELATINE . 52 B.6.3.2 NACHWEIS BAKTERIELLER EINZELZELLEN MIT MEHRFACHMARKIERTEN POLYNUKLEOTID SONDEN . 53 B.6.3.2. 1 HYBRIDISIERUNG . 53 B.6.3.2.2 DETEKTION DIG-MARKIERTER POLYNUKLEOTIDSONDEN . 54 B.6.3.3 KOMPETITIVE IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT MEHREREN POLYNUKLEOTIDSONDEN . 55 B.6.3. 3.1 PRINZIP . 55 B.6.3.3.2 KOMPETITIVEN IN SITU HYBRIDISIERUNG . 56 B.6.3.4 IN SITU DETEKTION VON EINZELZELLEN MIT OLIGONUKLEOTIDSONDEN . 57 B.6.3.5 IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT VERLAENGERTEN OLIGONUKLEOTIDEN . 58 B.6.3.6 KOMBINIERTER EINSATZ VON MEHRFACHMARKIERTEN POLYNUKLEOTIDSONDEN MIT EIN FACHMARKIERTEN OLIGONUKLEOTIDSONDEN . 58 B.7 P RIMED I N SITU L ABELING (PRINS) ZUR D ETEKTION BAKTERIELLER E INZELZELLEN . 59 I NHALTSVERZEICHNIS B.7.1 PRINZIP . 59 B.7.2 PRINS MIT RRNS UND MRNS-MATRIZEN . 59 B.7.2.1 VERWENDUNG DER AMV-RET . 59 B.7.2.2 VERWENDUNG DER TTH-DNS-POLYMERASE . 61 B.7.3 PRINS MIT RDNS UND PLASMID-MATRIZEN . 62 B . 8 D ETEKTION FLUORESZENZMARKIERTER Z ELLEN MIT E PIFLUORESZENZMIKROSKOPIE 63 B.9 D ETEKTION FLUORESZENZMARKIERTER Z ELLEN MIT KONFOKALER L ASERSCANNING - M IKROSKOPIE . 64 B. 10 E NTWICKLUNG UND A NWENDUNG EINES C OMPUTERPROGRAMMS ZUR Q UANTITATIVEN A NALYSE VON F LUORESZENZSIGNALEN . 65 B.10.1 BESTANDTEILE DES QUANTIFIZIERUNGSSYSTEMS. . 65 B.10.2 ENTWICKLUNG DES BILDVERARBEITUNGSPROGRAMMS . 65 B. 10.2.1 PRINZIP . 65 B. 10.2.2 STRUKTUR DES QUANTIFIZIERUNGSPROGRAMMS . 66 B.10.3 QUANTIFIZIERUNG VON FLUORESZENZSIGNALEN . 66 C ERGEBNISSE _ 69 C. 1 SENSMVRRAETS VERBESSERUNG DER IN SITU HYBRIDISIERUNG . 69 C.1.1 MEHRFACH MARKIERTE POLYNUKLEOTIDSONDEN . 69 C. 1.1.1 OPTIMIERUNG DER MARKIERUNGSEFFIZIENZ . 69 C. 1.1.2 AUSTESTEN VERSCHIEDENER RNS-POLYMERASEN . 71 C. 1.1.3 QUANTIFIZIERUNG MIT DIGITALER BILDVERARBEITUNG . 72 C.1.2 VERLAENGERTE OLIGONUKLEOTIDE . 76 C.L.2.1 OPTIMIERUNG DER TDT-VERLAENGERUNGSREAKTION . 76 C. 1.2.2 SPEZIFITAET VERLAENGERTER OLIGONUKLEOTIDE . 79 C. 1.2.3 QUANTIFIZIERUNG DER FLUORESZENZSIGNALE . 81 C.1.3 MARKIERUNG BAKTERIELLER EINZELZELLEN MIT YYPRIMED IN SITU LABELING " (PRINS) . 82 C. 1.3.1 AUSTESTEN VERSCHIEDENER FIXIERUNGSMETHODEN . 82 C.L.3.2 PRINS ZUM NACHWEIS VON RDNS UND RRNS . 82 C. 1.3.3 PRINS ZUM NACHWEIS VON MRNS . 83 C.2 V ERWENDUNG VOEN P OLYNUKLEOTIDSONDEN ZUR IN SITU A NALYSE MIKROBIELLER K ONSORTIEN IM B ELEBTSCHLAMM . 85 C.2.I ANLEGEN EINER GENBANK MIT DEN DOMAENE III-FRAGMENTEN DER 23S RRNS . 85 C.2. 1.1 OPTIMIERUNG DER NUKLEINSAEUREISOLATION . 85 C.2. 1.2 AMPLIFIKATION UND KLONIERUNG . 86 C.2. 1.3 ERGEBNIS EINER SEQUENZANALYSE DER ERSTELLTEN GENBANK . 87 C.2. 2 PRAEPARATION VON POLYNUKLEOTIDSONDEN . 88 C.2. 3 IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT GEGEN UMWELTSEQUENZEN GERICHTETEN POLYNUKLEOTIDEN 88 C.2.3. 1 SPEZIFITAET DER TRANSKRIPTSONDEN . 88 C.2.3.2 IN SITU ANALYSE MIKROBIELLER KONSORTIEN IM BELEBTSCHLAMM MIT POLYNUKLEO TIDSONDEN . 94 C.2.3.2. 1 IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT POLYNUKLEOTIDSONDEN . 94 C.2.3.2.2 DOPPELHYBRIDISIERUNG MIT OLIGO UND POLYNUKLEOTIDSONDEN . 96 I NHALTSVERZEICHNIS C.3 E INSATZ VON P OLYNUKLEOTIDSONDEN ZUR SPEZESSPEZEISCHEN D ETEKTION VON B AKTERIEN . 97 C.3. 1 HYBRIDISIERUNG VON POLYNUKLEOTIDSONDEN ZUR DETEKTION VON FILTERGEBUNDENER RRNS . 98 C.3. 1.1 OPTIMIERUNG DER HYBRIDISIERUNGS UND DETEKTIONSBEDINGUNGEN: . 98 C.3. 1.2 SPEZIESSPEZIFISCHE DETEKTION VON FILTERGEBUNDENER ACINETOBACTER-RRNS. 100 C.3. 1.2.1 DETEKTION VON A. CALCOACETICUS . 101 C.3. 1.2.2 DETEKTION VONA. BAUMANNII . 103 C.3.2 IN SITU DETEKTION VON ACINETOBACTER-SPEZIES . 104 C.3.2. 1 OPTIMIERUNG DER VORBEHANDLUNGS-UND HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN . 104 C.3.2.2 IN SITU NACHWEIS VON A. CALCOACETICUS UND A. BAUMANNII . 104 C.3.2.3 SIMULTANE IN SITU DETEKTION VON DREI VERSCHIEDENEN ACINETOBACTER-SPEZIES 106 D DISKUSSION _ 107 D.L SENSMVITAETSVERBESSERUNG DER IN SITU DETEKTION . 107 D.1.1 MEHRFACHMARKIERTE POLYNUKLEOTIDSONDEN . 107 D.L. 1.1 OPTIMIERUNG DER MARKIERUNGSEFFIZIENZ . 107 D.L. 1.2 AUSTESTEN VERSCHIEDENER RNS-POLYMERASEN . 108 D.L. 1.3 QUANTIFIZIERUNG MIT DIGITALER BILDVERARBEITUNG . 109 D.L. 2 VERLAENGERTE OLIGONUKLEOTIDE . 109 D.L. 2.1 OPTIMIERUNG DER TDT-VERLAENGERUNGSREAKTION . 109 D. 1.2.2 SPEZIFITAET VERLAENGERTER OLIGONUKLEOTIDE . 110 D. 1.2.3 QUANTIFIZIERUNG DER FLUORESZENZSIGNALE . 111 D.L. 3 MARKIERUNG BAKTERIELLER EINZELZELLEN MIT YYPRIMEDLN SITU LABELING" (PRINS). 112 D.2 V ERWENDUNG VON P OLYNUKLEOTIDSONDEN ZUR IN SITU A NALYSE MIKROBIELLER K ONSORTEN IM B ELEBTSCHLAMM . 113 D.2.1 ANLEGEN EINER GENBANK MIT DEN VARIABLEN DOMAENE III-FRAGMENTEN DER 23S RDNS . 114 D.2.2 IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT GEGEN UMWELTSEQUENZEN GERICHTETEN POLYNUKLEOTI DEN . 115 D.2.2. 1 SPEZIFITAET DER TRANSKRIPTSONDEN . 116 D.2.2.2 IN SITU ANALYSE MIKROBIELLER KONSORTIEN IM BELEBTSCHLAMM MIT POLYNUKLEO TIDSONDEN . 117 D.2.2.3 SIMULTANE DETEKTION VON KLAERSCHLAMMBAKTERIEN MIT POLY UND OLIGONUKLEO- TIDSONDEN . 119 D.2.3 BEURTEILUNG DES ANSATZES . 120 D.3 E INSATZ VON P OLYNUKLEOTIDSONDEN ZUR SPEZESSPEZEISCHEN D ETEKTION VON B AKTERIEN . 121 D.3.1 HYBRIDISIERUNG VON POLYNUKLEOTIDSONDEN ZUR DETEKTION VON FILTERGEBUNDENER RRNS . 122 D.3. 2 IN SITU DETEKTION VON ACINETOBACTER-SPEZIES . 124 D.3. 3 FAZIT. . 124 E ZUSAMMENFASSUNG ---------------------------------------------------------------------- 127 I NHALTSVERZEICHNIS F LITERATURVERZEICHNIS 129
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