Untersuchung des Arginin-Deiminase-Weges in Halobacterium salinarium:
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| Sprache: | German |
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
II
EINLEITUNG
.
4
III
ERGEBNISSE
.
12
1
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
KATABOLEN
OMITHIN
TRANSCARBAMOYLASE
.
12
1.1
ANAEROBES
WACHSTUM
MIT
ARGININ
IM
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
MOEGLICHKEITEN
DER
ENERGIEGEWINNUNG
.
12
1.2
REINIGUNG
DER
KATABOLEN
OMITHIN-TRANSCARBAMOYLASE
AUS
HALOBACTERIUM
SALINARIUM
.
14
1.3
BESTIMMUNG
DER
KM-WERTE
FUER
CARBAMOYLPHOSPHAT
UND
ORNITHIN
.
15
1.4
ABHAENGIGKEIT
DER
ENZYMAKTIVITAET
VON
DER
ARGININ-,
PHOSPHAT
UND
NUKLEOTIDKONZENTRATION
.
17
1.5
BESTIMMUNG
DES
PH-OPTIMUMS
UND
DER
ABHAENGIG
KEIT
VON
DER
SALZKONZENTRATION
.
18
1.6
ERMITTLUNG
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTS
DURCH
GELFILTRATION
.
20
1.7
BESTIMMUNG
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
N-TERMINUS
DER
COTCASE
UND
VON
VIER
PEPTIDEN,
DIE
DURCH
BRCN-
SPALTUNG
GEWONNEN
WURDEN
.
22
1.8
EINORDNUNG
DER
PEPTIDSEQUENZEN
IN
EIN
PROTEINALIGN-
MENT
MIT
BEKANNTEN
OTCASEN
.
22
2
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
ARCRA
CB-GENCLUSTERS
.
23
2.1
KLONIERUNG
EINES
DNA-FRAGMENTES,
DAS
FUER
ARCB,
ARCC
UND
DIE
3'-TERMINALE
SEQUENZ
VON
ARCA
CODIERT
.
23
2.2
KLONIERUNG
EINES
ZWEITEN
DNA-FRAGMENTES,
WELCHES
DAS
5'-ENDE
VON
ARCA,
ARCR
UND
WEITERE
5,2
KBP
GENOMI-
SCHER
DNA
ENTHAELT
.
25
2.3
CHARAKTERISIERUNG
VON
ARCB
.
27
2.4
EINORDNUNG
VON
ARCB
IN
EINEN
STAMMBAUM
MIT
GENEN
VON
OTCASEN
ANDERER
ORGANISMEN
.
30
2.5
CHARAKTERISIERUNG
VON
ARCC
.
32
2.6
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
ARCC
IN
HALOFERAX
VOLCANII
.
33
2.7
CHARAKTERISIERUNG
VON
ARCA
.
35
2.8
CHARAKTERISIERUNG
VON
ARCR
.
37
3
VERSUCHE
ZUR
REGULATION
DES
ARGININ-DEIMINASE-WEGES
.
40
3.1
LAENGENBESTIMMUNG
DER
TRANSKRIPTE
DES
ARCRA
CB-OPERONS
.
40
3.2
BESTIMMUNG
DER
5'-ENDEN
DER
MRNA
VON
ARCA,
ARCC,
ARCB
SOWIE
EINES
WEITEREN
TRANSKRIPTS
.
42
3.3
TRANSKRIPTION
DER
GENE
DES
ADI-WEGES
BEI
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
.
44
3.4
BESTIMMUNG
DER
OTCASE-AKTIVITAET
BEI
VERSCHIEDENEN
WACHSTUMSBEDINGUNGEN
.
47
4
HP7
1,
EIN
HALOBAKTERIELLES
PROTEIN
MIT
AEHNLICHKEIT
ZU
EUKARYONTISCHEN
CYTOSKELETTPROTEINEN
.
50
4.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
GENS
UND
DER
DARAUS
ABGE
LEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZ
.
50
4.2
EXPRESSION
VON
HP71
IN
E.
COLI
.
52
4.3
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
HP71
MIT
POLYKLONA
LEN
ANTIKOERPERN
AUS
HUEHNEREIERN
.
53
4.4
IMMUNOGOLD-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
55
IV
DISKUSSION
.
57
1
WACHSTUMSVERSUCHE
MIT
HALOBACTERIUM
SALINARIUM
.
57
2
ENZYMATISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
KATABOLEN
OMITHIN-TRANSCARBAMOYLASE
.
58
3
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
GENE
UND
GENPRODUKTE
DES
ARGININ-DEIMINASE-WEGES
.
62
4
REGULATION
DES
ARGININ-DEIMINASE-WEGES
.
68
5
HP71,
EIN
HALOBAKTERIELLES
CYTOSKELETTPROTEIN?
.
74
V
MATERIAL
UND
METHODEN
.
79
1
MATERIAL
.
79
1.1
CHEMIKALIEN,
REAGENZIEN
UND
LOESUNGEN
.
79
1.2
ENZYME
.
80
1.3
KITS
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
80
1.4
PLASMIDE
.
81
1.5
OLIGONUKLEOTIDE
.
81
1.6
PUFFER
UND
ANDERE
LOESUNGEN
.
82
1.7
GERAETE
.
89
2
VERWENDETE
ORGANISMEN
UND
ZELLZUCHT
.
90
2.1
NAEHRLOESUNGEN
.
90
2.2
STAEMME
DER
VERWENDETEN
ORGANISMEN
.
91
2.3
ZELLZUCHT
VON
HALOBACTERIUM
SALINARIUM
.
91
3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
93
3.1
PCR-REAKTIONEN
.
93
3.2
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
95
3.3
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.
COLI
.
96
3.4
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
H.
SALINARIUM
.
96
3.5
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
H.
SALINARIUM
.
97
3.6
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
UND
RNA
.
98
3.7
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
98
3.8
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
.
99
3.9
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
99
3.10
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
100
3.11
TRANSFORMATION
VON
HALOFERAX
VOLCANII
.
101
3.12
GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
UND
DNA
.
102
3.13
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
.
103
3.14
HERSTELLUNG
VON
DIG-MARKIERTEN
SONDEN
.
104
3.15
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-MARKIERTEN
SONDEN
UND
CHEMILUMINISZENSNACHWEIS
.
106
3.16
"COLONY-SCREENING"
.
106
3.16
DNA-SEQUENZIERUNG
.
107
3.17
PRIMEREXTENSION
MIT
GESAMT-RNA
AUS
H.
SALINARIUM
.
109
4
PROTEINCHEMISCHE
UND
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
111
4.1
HERSTELLUNG
DES
ROHEXTRAKTES
VON
H.
SALINARIUM
.
111
4.2
REINIGUNG
DER
OMITHIN-TRANSCARBAMOYLASE
.
111
4.3
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
OMITHIN-TRANS
CARBAMOYLASE
.
112
4.4
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
CARBAMAT-KINASE
.
112
4.5
CITRULLINBESTIMMUNG
.
114
4.6
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
IN
LOESUNGEN
.
115
4.7
BESTIMMUNG
DES
NATIVEN
MOLEKULARGEWICHTS
VON
PROTEINEN
DURCH
GELFILTRATION
.
115
4.8
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
116
4.9
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
UND
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
.
118
4.10
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
AUS
HUEHNEREIERN
.
119
4.11
WESTERN
BLOTTING
.
121
4.12
IMMUNOLOGISCHE
DETEKTION
VON
PROTEINEN
.
122
4.13
PROTEINSPALTUNG
MIT
BROMCYAN
.
122
LITERATUR
.
124
ABKUERZUNGEN
.
146
ANHANG
.
148 |
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