Untersuchungen zur Expression des Proteins NEFA:
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1995
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I
NHALTSVERZEICHNIS
SEITE
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
.
-V
T
ABELLENVERZEICHNIS
.
VN
A
BKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
IX
1.
Z
USAMMENFASSUNG
.
1
2.
E
INLEITUNG
.
2
3
.M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
.
4
3.1
REAGENZIEN
.
4
3.1.1
CHEMISCHE
REAGENZIEN
.
4
3.1.2
BIOCHEMISCHE
REAGENZIEN
.
5
3.1.3
SEREN,
ANTIKOERPER
UND
MATERIALIEN
FUER
DIE
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
5
3.1.4
STAMMLOESUNGEN
.
6
3J,
AUSGANGSMATERIAL
.
6
3.2.1
DAS
ANTI-FP
SERUM
.
6
3.2.2
DIE
ZELLINIEN
.
6
3.2.3
MEMBRANPRAEPARATION
.
7
3.2.3.1
DIFFERENTIALZENTRIFUGATION
.
7
3.2.3.2
SOLUBILISIERUNG
DER
ROHMEMBRANPROTEINE
.
8
3.3
ALLGEMEINE
UND
ANALYTISCHE
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
9
3.3.1
PROTEINKONZENTRIERUNG
.
9
3.3.1.1
ULTRAFILTRATIONEN
.
9
3.3.1.2
ACETONFFAELLUNG
.
9
3.3.1.3
CHLOROFORMFAELLUNG
.
10
3.3.1.4
VAKUUMTROCKNUNG
.
10
3.3.2
PROTEINBESTIMMUNGEN
.
10
3.3.2.1
PROTEINBESTIMMUNG
MIT
BCA
.
10
3.3.2.2
AMINOSAEUREANALYSE
.
11
3.3.3
GELELEKTROPHORESE
.
12
3.3.3.1
POLYACRYLAMID-GEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
12
3.3.3.2
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
.
14
3.3.4
PROTEINFARBUNGEN
IM
GEL
.
17
3.3.4.1
KOLLOIDALE
COOMASSIE-FAERBUNG
(NEUHOFFET
AL.,
1988)
.
17
3.3.4.2
SILBERFARBUNG
NACH
HEUKESHOVEN
(1986)
.
18
3.3.5
ELEKTROBLOTTEN
VON
PROTEINEN:
SEMIDRY
BLOTTEN
.
18
3.3.6
PROTEINFAERBUNGEN
AUFPVDF-MEMBRAN
.
20
3.3.6.1
REVERSIBLE
PONCEAU-FAERBUNG
.
20
33.6.2
IMMUNPEROXIDASETEST
.
20
3.3.7
HOCHDRUCK-FLUESSSIGKEITS-CHROMATOGRAPHIE
MIT
UMGEKEHRTEN
PHASEN
(RP-HPLC)
.
-21
3.3.8
AUTOMATISCHER
EDMAN
ABBAU
AUF
DEM
GASPHASENSEQUENATOR
.
2A
3.3.9
PLASMA-DESORPTIONS-MAASSENSPEKTROMETRIE
(PDMS)
.
-24
3.4
PRAEPARATIVE
AUFARBEITUNG
ZUR
ANSEQUENZIERUNG DES PROTEINS
NEFA
.
25
3.4.1
TRAEGERFREIE
PRAEPARATIVE
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(EGEN
ET
AL.,
1987)
.
25
3.4.2
PRAEPARATIVE
SDS-PAGE
.
26
3.4.3
PRAEPARATIVE
ELEKTROELUTION
.
26
3.4.4
ISOLIERUNG
VON
NEFA
DURCH
RP-HPLC
.
21
3.4.5
THERMOLYSINSPALTUNG
.
21
3.5
UNTERSUCHUNGEN
AN
IMMUNKOMPLEXEN
.28
3.5.1
OBERFLAECHENMARKIERUNG
DURCH
BIOTINYLIERUNG
UND
LYSE
DER
ZELLEN
(COLE
ET
AL.,
1987)
.
2S
3.5.2
IMMUNKOMPLEXBILDUNG
.
29
3.5.2.1
HERSTELLUG
UND
ABTRENNUNG
DES
PRAEIMMUNKOMPLEXES
.
29
3.5.2.2
HERSTELLUNG
UND
ISOLIERUNG
DERFP-,J5
UND
12A1-IMMUNKOMPLEXE
.
-30
3.5.2.3
ISOLIERUNG
DER
BIOTINYLIERTEN
IMMUNKOMPLEXE
.
30
3.5.3
J5-AFFINITAETSSCHROMATOGRAPHIE
.
31
3.5.3.1
HERSTELLUNG
DER
J5-SAEULE
.
31
3.53.2
ANWENDUNG
DER
J5-SAEULE
.
.33
3.6
PEPTIDSYNTHESE
.
33
3.6.1
STRATEGIE
DER
PEPTIDSYNTHESE
.
-33
3.6.2
PROTOKOLL
DER
PEPIDSYNTHESE
.
.34
3.7
HERSTELLUNG
UND
ANWENDUNG
DER ANTI-PEPTID
SEREN
.
36
3.7.1
KOPPLUNG
DER
PEPTIDE
AN
HEMOCYANIN
.
36
3.7.2
IMMUNISIERUNG
UND
GEWINNUNG
DER
ANTI-PEPTID
SEREN
.
37
3.7.3
IMMUNOBLOT
.
38
3.7.4
ELISA
(ENZYME
LINKED
IMMUNO
SORBENT
ASSAY)
.
38
3.7.5
IMMUNFLUORESZENZ
.
.40
3.8
ISOLIERUNG
VON
MEMBRANVESIKEIN
MITTELS
LENTIL
LECTIN
.42
4.
E
RGEBNISSE
.
.44
4.1
ELEKTROPHORETISCHE
ANALYSE
DES
PROTEINS
NEFA
UND
DARSTELLUNG
EINES
MIT
DEM
ANTI-FP
SERUM
REAGIERENDEN
90KDA-PROTEINS
.
.44
4.1.1
EINDIMENSIONALE
DARSTELLUNG
DES
PROTEINS
NEFA
UND
EINES
90KDA-PROTEINS
IM
IMMUNOBLOT
NACH
DIFIERENTIALZENTRIFUGATION
DES
HOMOGENATS
DER
ZELLE
KM-3.
.
.44
4.1.2
ZWEIDIMENSIONALE
DARSTELLUNG
VON
NEFA
UND
DES
90KDA-PROTEINS
AUS
DER
ZYTOSOLISCHEN
FRAKTION
UND
DES
ROHMEMBRANSOLUBILISATES
DER
ZELLE
KM-3.
-
46
4.1.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
LENTIL-LECTIN-SEPHAROSE
.
48
4.2
DIE
PRAEPARATIVE
AUFARBEITUNG
UND
ANSEQUENZIERUNG
DES
PROTEINS
NEFA.
-49
4.3
UNTERSUCHUNGEN
AN
IMMUNKOMPLEXEN
.
35
4.3.1
DIE
ISOLIERUNG
DES
IMMUNKOMPLEXES
MIT
ANTI-FP
SERUM
NACH
BIOTINYLIERUNG
DER
ZELLOBERFLAECHENPROTEINE
DER
ZELLINIEN
H2LCL
UND
KM-3.
.
-58
4.3.2
DIE
ISOLIERUNG
DES
IMMUNKOMPLEXES
MIT
MAK
15
NACH
BIOTINYLIERUNG
DER
ZELLOBERFLAECHENPROTEINE
DER
ZELLINIE
KM-3.
.
63
4.3.3
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
IMMOBILISIERTEM
UND
KREUZVEMETZTEM
MAK
15.
-64
4.3.4
DIE
ISOLIERUNG
DES
IMMUNKOMPLEXES
MIT
MAK
12A1
NACH
BIOTINYLIERUNG
DER
ZELLOBERFLAECHENPROTEINE
DER
ZELLINIE
KM-3.
.
69
4.4
DIE
SYNTHETISCHEN
PEPTIDE
.
-71
4.4.1
DIE
SYNTHESE,
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
PEPTIDEN.
.
73
4.4.2
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTISEREN
GEGEN
DIE
SYNTHETISCHEN
PEPTIDE.
.
-77
4.4.3
DIE
ANWENDUNG
DER
POLYKLONALEN
ANTISEREN
GEGEN
DIE
SYNTHETISCHEN
PEPTIDE.
-78
4.4.4
DIE
UNTERSUCHUNG
VON
KREUZREAKTIVITAETEN
DES
MAK
15
UND
DES
ANTI-FP
SERUMS.
.
.90
5.
D
ISKUSSION
.
-93
5.1
DIE
MEMBRANASSOZIIERTE
EXPRESSION
DES
PROTEINS
NEFA.
.
-93
5.2
OFFENE
FRAGEN
ZUR
MEMBRANASSOZIATION
DES
PROTEINS
NEFA.
.
-97
5.3
DIMERISIERUNG
DES
PROTEINS
NEFA.
.
59
5.4
DIE
KREUZREAKTION
DES
ANTI-CALLA
MAK
J5
MIT
NEFA.
.
101
5.5
FAZIT
.102
6.
L
ITERATURVERZEICHNIS
.104
D
ANKSAGUNGEN
.113
L
EBENSLAUF
.
114 |
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