Die Myosin-Genfamilie in Pflanzen: ein Vergleich zwischen der einzelligen Grünalge Acetabularia cliftoni S.-L. und der höheren Pflanze Helianthus annuus L.
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
I
1.1
KONVENTIONELLES
UND
UNKONVENTIONELLES
MYOSIN
1
1.2
MYOSIN:
MODULARER
AUFBAU
UND
MOTORFUNKTION
3
1.3
MYOSIN
FUNKTION
IN
VIVO
5
1.4
MYOSIN
IN
PFLANZEN
?
6
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
2.1
MATERIAL
9
2.1.1
PFLANZENMATERIAL
9
2.1.2
GENBIBLIOTHEKEN
9
2.1.3
BAKTERIENSTAEMME
UND
PHAGEN
9
2.1.4
PLASMIDE
10
2.1.5
OLIGONUKLEOTID-PRITNER
10
2.1.6
LAENGENSTANDARDS
10
2.1.7
ENZYME
11
2.1.8
KITS
11
2.1.9
ANTIKOERPER
12
2.1.10
BAKTERIELLE
NAEHNNEDIEN,
AGARPLATTEN
UND
ANTIBIOTIKA
12
2.1.11
RADIOCHENUKALIEN
12
2.1.12
CHEMIKALIEN
13
2.1.13
LOSUNGEN
UND
PUFFER
14
2.1.14
SPEZIELLE
MATERIALIEN
UND
GERAETE
15
2.2
METHODEN
16
2.2.1
PFLANZENZUCHT
16
2.2.2
NUKLEINSAEUREN
16
2.2.2.1
DNA-EXTRAKTION
AUS
ACETABULANA
CLIFTONI
16
2.2.2.2
DNA-EXTRAKTION
AUS
HELIANTHUS
ANNUUS
17
2.2.2.3
ALLGEMEINE NUKLEINSAEURE-BEHANDLUNG
17
2.2.2.4
PLASMID-EXTRAKTION
18
2.2.2.5
PRAEPARATION
VON
Z-PHAGEN
DNA
19
2.2.2.6
RNA-EXTRAKTION
20
2.2.2.7
POLY(A)
+
-MRNA
EXTRAKTION
20
2.2.3
PCR-ANWENDUNGEN
21
2.2.3.1
PCR
21
2.2.3.2
CDNA-SYNTHESE
22
2.2.3.2.1
CDNA-SYNTHESE
FUER
REVERS-TRANSKRIPTIONS-PCR (RT-PCR)
22
2.2.3.2.2
5'-RACE
23
2.2.3.2.3
OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE
IN
VITRO
MUTAGENESE
23
2.2.4
KLONIERUNG
24
2.2.4.1
RESTRIKTION VON
DNA
24
2.2.4.2
LIGATION
VON
DNA
24
2.2.5
VEKTORPRAPARATION
25
2.2.5.1
KLONIERUNGS-VEKTOR
MIT
KOHAESIVEN
ENDEN
25
2.2.5.2
KLONIERUNGS-VEKTOR
MIT
D(T)-UEBERHANG
25
2.2.6
KONSTRUKTION
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
26
2.2.7
DNA-ELEKTROPHORESE
30
2.2.7.1
ANALYTISCHE
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
30
2.2.7.2
PRAEPARATIVE
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
30
2.2.7.3
POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
31
2.2.8
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
31
2.2.8.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
FUER
DIE
INFEKTION
MIT
Z-PHAGEN
31
2.2.8.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
FUER
DIE
PLASMID-TRANSFORMATION
32
2.2.8.2.1
TRANSFONNATION
32
2.2.8.3
'IN
VIVO
EXCISION'
VON
PBLUESCRIPT
SK(-)
AUS
UNI-ZAPYY
XR
32
2.2.9
NUKLEINSAEURE-NACHWEISMETHODEN
33
2.2.9.1
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
(BLOTTING)
33
2.2.9.1.1
SOUTHERN
BLOT
33
2.2.9.1.2
REPLIKA
BLOT
VON
BAKTENEN-KOLONIEN
34
2.2.9.1.3
REPLIKA
BLOT
VON
X-PHAGEN
PLAQUES
34
2.2.9.1.4
NORTHERN
BLOT
35
2.2.9.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
35
2.2.9.3
HYBRIDISIERUNG
36
2.2.10
DNA-SEQUENZIERUNG
37
2.2.11
AUFARBEITUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
38
2.2.12
COMPUTER-GESTUTZTE
SEQUENZANALYSEN
38
2.2.13
BAKTERIELLE
EXPRESSION
UND
PROTEINANALYSEN
39
2.2.13.1
EXPRESSION
VON
FREMDGENEN
IN
E
COLI
40
2.2.13.2
SDS-POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
40
2.2.13.3
WESTERN
BLOT
41
2.2.14
IN
VITRO
TRANSKRIPTION/TRANSLATION
41
3.
ERGEBNISSE
42
3.1
CDNA-BIBLIOTHEKEN
42
3.1.1
DIE
HELIANTHUS
ANNUUS
CDNA-BIBHOTHEK
42
3.1.2
DIE
ACETABULARIA
CLIFTONI
CDNA-BIBLIOTHEKEN
43
3.2
HERSTELLUNG
VON
HOMOLOGEN
MYOSIN-GENSONDEN
44
3.2.1
PCR
AUS
HEHANTHUS-CDNA
44
3.2.2
PCR
AUS
ACETABULARIA-CDNA.
44
3.3
SCREENING
VON
CDNA-BIBLIOTHEKEN
45
3.3.1
MYOSIN
CDNA-SEQUENZEN
AUS
HELIANTHUS ANNUUS
45
3.3
2
MYOSIN
CDNA-SEQUENZEN
AUS
ACETABULARIA
CLIFTONI
46
3.4
KLONIERUNG
VON
TEILBEREICHEN
VERSCHIEDENER
MYOSIN-CDNAS
46
3.4.1
DAS
HELIANTHUS
MYOSIN-TRANSKRIPT
HAMYOKL
46
3.4.1.1
KLONIERUNG
VON
HAMYOKLC
48
3.4.2
DAS
HELIANTHUS
MYOSIN-TRANSKRIPT
HAMYOK2
48
3.4.3
DAS
HELIANTHUS
MYOSIN-TRANSKRIPT
HAMYOK3
49
3.4.3.1
VERSUCH
DER
KLONIERUNG
VON
HAMYOK3B
50
3.4.4
DAS
ACETABULARIA
MYOSIN-TRANSKRIPT ACMYO2
51
3.5
VOLLSTAENDIGE
CDNA-SEQUENZEN
UND
-KLONE
52
3.5.1
DER
HELIANTHUS
MYOSIN
CDNA-KLON
HAMYOKLC
52
3.5.2
DIE
HELIANTHUS
MYOSIN
CDNA-SEQUENZ
HAMYOK2
54
3.5.3
DIE
HELIANTHUS
MYOSIN
CDNA-SEQUENZ
HAMYOK3
56
3.5.4
DER
HELIANTHUS
MYOSIN
CDNA-KLON
HAMYOK4
58
3.5.5
DER
HELIANTHUS
MYOSIN
CDNA-KLON
HAMYOK5
61
3.5.6
DER
ACETABULARIA
MYOSIN
CDNA-KLON
ACMYOL
64
3.5.7
DIE
ACETABULARIA
MYOSIN
CDNA-SEQUENZ
ACMYO2
66
3.6
SEQUENZVERGLEICHE
DER
UNTERSUCHTEN
MYOSINE
67
3.6.1
AMINOSAURESEQUENZ-VERGLEICH
DER
PFLANZLICHEN MYOSINE
68
3.6.2
SCHEMATISCHE
DARSTELLUNG
DES
MYOSIN-AUFBAUS
UND
DER
DOMAENEN-ANORDNUNG
71
3.6.3
DER
MYOSIN-SEQUENZVERGLEICH
MIT
HILFE
DES'DOT
PLOT'-PROGRAMMS
71
3.6.4
AMINOSAURESEQUENZ-HOMOLOGIEN
DER
MOTORDOMAENEN
73
3.6.5
MYOSIN-DOMAENEN
74
3.6.6
IQ-MOTIVE
76
3.6.7
ALPHA-HELIKALE'COILEDCOIL'-BEREICHE
TI
3.6.8
SONSTIGE
MOTIVE
78
3.6.9
KODON-GEBRAUCH
78
3.6.9.1
DER
KODON-GEBRAUCH
VON
HELIANTHUS
ANNUUS
79
3.6.9.2
DER
KODON-GEBRAUCH
VON
ACETABULARIA
CLIFTONI
80
3.6.10
STATISTIKEN
ZUR
BASENVERTEILUNG
IN
DEN
UNTERSUCHTEN
MYOSINEN
80
3.7
SCREENING
DER
ACETABULARIA
GEN-BIBLIOTHEK
81
3.7.1
SCREENING
MIT
DEM
MYOSIN
CDNA-KLON
ACMYOL
81
3.7.2
DAS
ACETABULARIA
MYOSM-GEN
ACMGVL
83
3.7.3
SCREENING
MIT
DEM
MYOSIN PCR-FRAGMENT ACMPCR2
86
3.7.4
DAS
ACETABULARIA
MYOSIN-GEN
ACMGV2
88
3,8
DER
ACETABULARIA
MYOSIN-GENAUFBAU
91
3.8.1
EXON/INIRON-VERTEILUNG
IN
ACMGVL
UND
ACMGV2
91
3.8.2
DIE
PROMOTOR-BEREICHE
DER
MYOSM-GENE
92
3.8.3
SPLEISSSTELLEN
94
3.8.4
REPEAT-ELEMENTE
IN
INTRONS
DER
ACETABULARIA
MYOSIN-GENE
95
3.8.5
SONSTIGE
BESONDERHEITEN
96
3.9
SOUTHERN
BLOT-ANALYSEN
97
3.9.1
SOUTHERN
BLOIS
MIT
HELIANTHUS
ANNUUS-DNA
97
3.9.2
SOUTHERN
BLOTS
MIT
ACETABULARIA
CLIFTONI-DNA
99
3.10
NORTHERN
BLOT-ANALYSEN
100
3.10.1
NORTHERN
BLOTS
MIT
HELIANTHUS
ANNUUS-RNA
100
3.10.2
NORTHERN
BLOTS
MIT
ACETABULARIA
CLIFTONI-RNA
103
3.11
BAKTERIELLE
EXPRESSION
106
3.11.1
EXPRESSIONSVEKTOREN
UND
KLONIERUNGSSTRATEGIE
106
3.11.2
BAKTERIELLE
EXPRESSION
VON
AKTIN
107
3.11.2.1
KLONIERUNG
DES
AKTIN-EXPRESSIONSVEKTORS
PETV2AKTL
108
3.11.2.2
EXPRESSION
VON
ACETABULARIA-AKTIN
IN
E.
COLI
109
3.11.3
BAKTERIELLE
EXPRESSION
VON MYOSIN
111
3.11.3.1
KLONIERUNG
DES
MYOSIN-EXPRESSIONSVEKTORS
PETV2MSP
111
3.11.3.2
VERSUCH
DER
EXPRESSION
VON
ACETABULARIA-MYOSIN
IN
E.
COLI
114
3.12
ZN
VITRO
TRANSLATION
115
4.
DISKUSSION
117
4.1
DIE
MYOSIN-GROESSENKLASSEN
DER
PFLANZEN
118
4.2
MYOSIN-AUFBAU
IN
PFLANZEN
119
4.2.1
DIE
MYOSIN-KOPFREGION
119
4.2.2
DER
MYOSM-CARBOXYTERMINUS
128
4.3
DIE
PFLANZLICHEN
MYOSIN-TRANSKRIPTE
130
4.3.1
HELIANTHUS-MYOSIN
130
4.3.2
ACETABULARIA-MYOSIN
132
4.3.3
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
UND
MYOSIN-DIVERSITAET
133
4.4
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ACETABULARIA
MYOSIN-GENANALYSEN
135
4.4.1
PROMOLOREN
135
4.4.2
INTRONS
136
4.5
KODONGEBRAUCH
UND
BAKTERIELLE
EXPRESSION
VON
ACETABULARIA-GENEN
139
4.6
PHYLOGENETISCHE
ANALYSE
141
4.7
PERSPEKTIVEN
143
5.
ZUSAMMENFASSUNG
144
6.
LITERATURVERZEICHNIS
146
7.
VEROEFFENTLICHUNGEN
UND
PRAESENTATIONEN
166
APPENDIX |
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