Untersuchungen zur Cyclophilin-Expression unter Stressbedingungen bei Digitalis lanata:
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1995
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IMAGE 1
- 33 2
UNTERSUCHUNGEN ZUR CYCLOPHILIN-EXPRESSION UNTER STRESSBEDINGUNGEN BEI
DIGITALIS LANATA
DISSERTATIONSSCHRIFT
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES
DOCTOR RERUM NATURALIUM ( DR. RER. NAT. )
VORGELEGT DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER
MARTIN-LUTHER-UNIVERSITAET HALLE-WITTENBERG
VON APOTHEKER ANDREAS LIEBAU GEBOREN AM 16.10.1964 IN TORGAU / SACHSEN
GUTACHTER : 1.
2.
3.
HALLE/SAALE, IM AUGUST 1995
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 1
1.2. URSACHEN DER SCHAEDIGUNG WAEHREND DER KRYOKONSERVIERUNG 2
1. 3. WIRKUNGSMECHANISMEN DER KRYOPROTEKTOREN 3
1.4. STRESSFAKTOREN WAEHREND DER VORKULTIVIERUNG 4
1.5. VORKOMMEN UND FUNKTION VON PPIASEN 5
1.6. SOMATISCHE EMBRYOGENESE 6
2. MATERIAL UND METHODEN 10
2. 1. NAEHRMEDIEN 10
2. 2. STAMMERHALTUNG UND KULTIVIERUNG 11
2. 3. KRYOKONSERVIERUNG 11
2. 3. 1. KRYOPROTEKTOR-LOESUNGEN 11
2. 3. 2. FRIERREGIME 12
2. 3. 3. LAGERUNG DES GEFRORENEN MATERIALS 12
2. 3. 4. TAUREGIME 12
2. 3. 5. VITALITAETSBESTIMMUNG 12
2. 3. 6. HERSTELLUNG DES ZELLPRESSSAFTES 12
2. 4. PROTEINISOLIERUNG UND ELEKTROPHORESE 13
2. 4. 1. PROTEINISOLIERUNG 13
2. 4. 2. ELEKTROPHORETISCHE PROTEINAUFTRENNUNG 13
2. 4. 3. HPLC-UNTERSUCHUNGEN 14
2. 4. 3. 1. FPLC- UND HPLC-SYSTEM 14
2. 4. 3. 2. SAEULENMATERIAL 14
2. 4. 3. 3. FREE-FLOW-IEF 14
2. 4. 3. 4. PPIASE-AKTIVITAETSBESTIMMUNG 15
2. 4. 4. PROTEINFRAGMENTIERUNG 15
2. 4. 4. 1. ALKYLIERUNG DER CYSTEINE 15
2. 4. 4. 2. PROTEINSPALTUNG MIT TRYPSIN 16
2. 5. ISOLATION VON GESAMT- UND MRNA AUS DIGITALIS LANATA ZEIL- UND
GEWEBEKULTUREN
WAEHREND DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE 16
2. 5. 1. ISOLATION VON GESAMT-RNA 16
2. 5. 2. SPEKTROPHOTOMETRISCHE EINSCHAETZUNG DER EXTRAKTIONSMETHODE 17 2.
5. 3. ISOLATION VON MRNA AUS GESAMT-RNA 18
2. 5. 4. EINSCHAETZUNG DER KONZENTRATION VON MRNA-PROBEN 18
2. 5. 5. AUFTRENNUNG VON GESAMT- UND MRNA IN DENATURIERENDEN
AGAROSEGELEN 18 2. 5. 6. NORTHERN-TRANSFER AUF NYLONMEMBRAN 19
IMAGE 3
2 . 6. NORTHERN HYBRIDISIERUNG 20
2. 6. 1. HYBRIDISIERUNG VON RNA MIT RADIOAKTIV MARKIERTER CDNA 20
2. 6. 2. RADIOAKTIVE MARKIERUNG DER CDNA 21
2. 7. WESTERN BLOT 21
2. 8. QUANTITATIVE AFFINITAETSBESTIMMUNG 21
3. ERGEBNISSE 23
3. 1. OPTIMIERUNG DES FRIERREGIMES 23
3. 1. 1. ABKUEHLUNGSGESCHWINDIGKEIT 23
3. 1. 2.KRYOPROTEKTOREN 24
3. 2. VORKULTIVIERUNG UNTER STRESSBEDINGUNGEN 25
3.2. 1. VORKULTIVIERUNG MIT KAELTESTRESS 26
3. 2. 1. 1. PROEMBRYOGENE MASSEN 26
3.2. 1.2. GLOBULAERE EMBRYONEN ( STAGE I) 27
3. 2. 1.3. HERZ-TORPEDO-STADIUM 28
3. 2. 2. VORKULTIVIERUNG UNTER OSMOTISCHEM STRESS MIT SORBITOL 29
3. 2. 2. 1. PROEMBRYOGENE MASSEN 29
3. 2. 2. 2. GLOBULAERE EMBRYONEN ( STAGE I) 31
3. 2. 2. 3. HERZ-TORPEDO-STADIUM 32
4. 2. 3. VORKULTIVIERUNG MIT ABSCISINSAEURE 32
3. 2. 3. 1. PROEMBRYOGENE MASSEN 33
3 . 2 . 3 . 2. GLOBULAERE EMBRYONEN ( STAGE I) 34
3. 2. 3. 3. HERZ-TORPEDO-STADIUM 35
3. 2. 4. VORKULTIVIERUNG MIT JASMONSAEURE 35
3. 2. 4. 1. PROEMBRYOGENE MASSEN 36
3. 2. 4. 2. GLOBULAERE EMBRYONEN ( STAGE I) 37
3. 2. 4. 3. HERZ-TORPEDO-STADIUM 38
3. 2. 5. VORKULTIVIERUNG MIT KOMBINATIONEN VON STRESSFAKTOREN 38
3. 2. 5. 1. SORBITOL UND ABSCISINSAEURE 38
3. 2. 5. 1. 1. PROEMBRYOGENE MASSEN 39
3. 2. 5. 1.2. GLOBULAERE EMBRYONEN ( STAGE I) 41
3. 2. 5. 1. 3. HERZ-TORPEDO-STADIUM 42
3. 2. 5. 2. SORBITOL UND JASMONSAEURE 43
3. 2. 5. 2. 1. PROEMBRYOGENE MASSEN 43
3. 2. 5. 2. 2. GLOBULAERE EMBRYONEN ( STAGE I) 45
3.2.5.2.3.HERZ-TORPEDO-STADIUM 45
3 . 3. UNTERSUCHUNG DER STRESS INDUZIERTEN PROTEINE 46
3. 3. 1. UNTERSUCHUNG DER PPIASE-AKTIVITAET 47
3. 3. 2. ISOLIERUNG STRESSREGULIERTER PPIASEN 47
3. 3. 2. 1. EIGNUNG VERSCHIEDENER TRENNPRINZIPIEN 47
IMAGE 4
3. 3. 2. 1. 1. IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 48
3. 3. 2. 1. 2. GELVERTEILUNGSCHROMATOGRAPHIE 51
3. 3. 2. 2. ISOLIERUNG STRESSREGULIERTER CYCLOPHILINE 53
3. 3. 2. 3. CHARAKTERISIERUNG DER STRESSINDUZIERTEN CYCLOPHILINE 55
3. 3. 2. 3. 1. BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTS 55
3. 3. 2. 3. 2. SEQUENZIERUNG DER CYP 18 57
3. 3. 3. UNTERSUCHUNG DER CYP18-EXPRESSION DURCH NORTHERN HYBRIDISIERUNG
60 3. 3. 4. TRENNUNG DER CYTOSOLISCHEN CYP18 UNTER NATIVEN BEDINGUNGEN
64 3. 3. 4. 1. FPLC-UNTERSUCHUNGEN 64
3. 3. 4. 2. KONTINUIERLICHE FREE-FLOW-IEF 64
3. 3. 5. UNTERSUCHUNG DER CYCLOPHILIN-INDUKTION AUF PROTEINEBENE 71
4. DISKUSSION 73
4. 1. FRIER-TAU-PROZESS 73
4. 2. EINFLUSS DES STADIUMS DER SOMATISCHEN EMBRYOGENESE AUF DIE
KRYOKONSERVIERUNG 74 4. 3. VORKULTIVIERUNG UNTER STRESSBEDINGUNGEN 75
4. 3. 1. VORKULTIVIERUNG UNTER KAELTESTRESS 76
4. 3. 2. VORKULTIVIERUNG UNTER OSMOTISCHEM STRESS 77
4. 3. 3. VORKULTIVIERUNG MIT ABSCISINSAEURE 80
4. 3. 4. VORKULTIVIERUNG MIT JASMONSAEURE 83
4. 3. 5. KOMBINATIONEN MEHRERER STRESSFAKTOREN 85
4 . 4. VORKOMMEN UND FUNKTION VON PPIASEN 86
4. 4. 1. VORKOMMEN VON PPIASEN IN PFLANZEN 87
4. 4. 2. FUNKTIONEN VON PPIASEN 89
4. 4. 2. 1. PROTEINFALTUNG 89
4. 4. 2. 2. PPIASEN UND STRESS 90
4. 4. 2. 3. INTERAKTIONEN MIT CALCINEURIN 93
4. 4. 3. SEQUENZMERKMALE PFLANZLICHER CYCLOPHILINE 94
5. ZUSAMMENFASSUNG 96
6. LITERATURVERZEICHNIS 98 |
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