Antikörper aus Escherichia coli: Untersuchung und Optimierung der In-vivo-Faltung
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INHALT
I
I
NHALT
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
REKOMBMANTE
PROTEINE
UND
YYPROTEIN
ENGINEERING
"
.
2
1.2
ANTIKOERPEREXPRESSION
IN
BAKTERIEN
.
3
1.3
FALTUNG
VON
PROTEINEN:
EIN
UNGELOESTES
PROBLEM
.
9
1.4
AUFGABENSTELLUNG
.
13
2
MATERIALIEN
.
15
2.1
BIOLOGISCHES
MATERIAL
.
15
2.2
OLIGODESOXYNUKLEOTIDE
.
18
2.3
PROTEINE
UND
PEPTIDE
.
25
2.4
CHEMIKALIEN
.
26
2.5
STANDARDS
UND
KITS
.
28
2.6
NAEHRMEDIEN,
ANTIBIOTIKA-LOESUNGEN
UND
HAEUFIG
VERWENDETE
PUFFER
.
29
2.7
SAEULENMATERIALIEN.
34
2.8
GERAETE
.
35
2.9
SONSTIGES
MATERIAL
.
36
3
EXPERIMENTELLE
METHODEN
.
38
3.1
GENTECHNISCHE
METHODEN
.
38
3.1.1
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
.
38
3.1.2
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
38
3.1.3
GELELEKTROPHORESE
.
39
3.1.4
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
UND
MODIFIKATION
VON
DNA
.
40
3.1.5
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
41
3.1.6
REINIGUNG
VON
OLIGODESOXYNUKLEOTIDEN.
41
3.1.7
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
NACH
KUNKEL
.
42
3.1.8
SEQUENZANALYSE
VON
DNA
.
44
3.1.9
PCR-TECHNIKEN
.
44
3.2
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
47
3.2.1
ANZUCHT
UND
AUFBEWAHRUNG
VON
E.
CO/I-STAEMMEA
.
47
3.2.2
UNTERSUCHUNG
DES
EXPRESSIONSVERHALTENS
.
47
N
3.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
50
3.3.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
50
3.3.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
51
3.3.3
MESSUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
.
52
3.3.4
SEQUENZIERUNG
DES
AMINOTERMINUS
VON
PROTEINEN
.
56
3.4
PRODUKTION
REKOMBINANTER
PROTEINE
.
56
3.4.1
ANZUCHT
DER
KULTUREN
.
56
3.4.2
PRAEPARATIVER
ZELLAUFSCHLUSS
.
56
3.4.3
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPERFRAGMENTEN
.
57
3.4.4
REINIGUNG
DER
E.
CO/I-PPIASE
.
59
3.5
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
59
3.5.1
GEWINNUNG
VON
ANTISERUM
.
59
3.5.2
IMMUNOBLOTTING
.
60
3.6
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
.
62
3.6.1
SPEKTROPHOTOMETRIE
.
62
3.6.2
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
.
63
3.7
COMPUTERUNTERSTUETZTE
ANALYSE
UND
AUSWERTUNG
.
72
4
ERGEBNISSE.
.
73
4.1
VORBEMERKUNGEN
.
73
4.2
WAS
BEEINFLUSST
DIE
AUSBEUTE?
.
75
4.2.1
ZUSAMMENSTELLUNG
BEKANNTER
DATEN
ZUR
ANTIKOERPER-EXPRESSION
IN
E.
COLI
.
75
4.2.2
VORVERSUCHE
ZUR
IN
WVO-FALTUNG
.
77
4.3
DER
EINFLUSS
VON
FALTUNGSKATALYSATOREN
AUF
DIE
IN
VIVO-AUSBEUTE
VON
REKOMBINANT
EXPRIMIERTEN
ANTIKOERPERFRAGMENTEN
.
81
4.3.1
VORUEBERLEGUNGEN
.
81
4.3.2
KONSTRUKTION
DER
VEKTOREN
.
85
4.3.3
VERGLEICH
DER
ZWEI
SCFV-VARIANTEN
.
91
4.3.4
NACHWEIS
DER
UBEREXPRESSION
DER
FALTUNGSENZYME
.
95
4.3.5
BESTIMMUNG
DER
AUSBEUTEN
AN
ANTIKOERPER-FRAGMENT
.
100
4.3.6
DIE
IN
VZVO-FALTUNG
VON
DSFV-FRAGMENTEN
BEI
COEXPRESSION
VON
DSBA
.
102
4.3.7
ABHAENGIGKEIT
DER
ZELLSTABILITAET
VON
DER
COEXPRESSION
VON
FALTUNGSKATALYSATOREN.
109
4.3.8
ZUSAMMENFASSUNG
.
111
4.4
IDENTIFIZIERUNG
VON
PUNKTMUTATIONEN
IM
ANTIKOERPENNOLEKUEL,
DIE
DIE
AUSBEUTE
BEEINFLUSSEN
.
112
4.4.1
VORUEBERLEGUNGEN
.
112
INHALT
HI
4.4.1.1
KONSTRUKTION
DER
PHJ
-
VEKTORREIHE
.
114
4.4.1.2
DAS
FLAG-SYSTEM
.
116
4.4.1.3
MESSUNG
DER
ZELLSTABILITAET
WAEHREND
DER
ANTIKOERPEREXPRESSION
.
136
4.4.1.4
IN
VZVO-FALTUNG:
DAS
MESSSYSTEM
IM
UEBERBLICK
.
138
4.4.2
DAS
MODELLSYSTEM
.
140
4.4.3
DIE
AUSBEUTE
UND
STABILITAET
DER
EXPRIMIERENDEN
ZELLEN
IST
ABHAENGIG
VON
DER
SEQUENZ
DES
ANTIKOERPERS
.
143
4.4.3.1
EXPRESSION
VON
HU4D5
MIT
HILFE
DES
PAK19-VEKTORS
.
143
4.4.3.2
INSERTION
DER
HU4D5-SEQUENZEN
IN
DIE
PHJ-VEKTORREIHE
.
145
4.4.3.3
EXPRESSION
VON
HU4D5
MIT
HILFE
DER
PHI-VEKTOREN
.
152
4.4.3.4
VERGLEICH
DER
EXPRESSION
VON
MCPC603
UND
HU4D5
.
156
4.4.3.5
DIE
MCPC603
VH-DOMAENE
LIMITIERT
DIE
AUSBEUTE
.
157
4.4.3.6
ZUSAMMENFASSUNG
.
159
4.4.4
PUNKTMUTATIONEN
IN
DER
VH-DOMAENE
DES
MCPC603-ANTIKOERPERS
BEEINFLUSSEN
DIE
IN
VZVO-FALTUNG
.
159
4.4.4.1
AUSWAHL
DER
PUNKTMUTATIONEN
.
159
4.4.4.2
HERSTELLUNG
DER PUNKTMUTATIONEN
.
163
4.4.4.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
VARIANTEN
IN
VIVO
.
164
4.4.4.4
ZUSAMMENFASSUNG
.
171
4.4.5
DIE
IN
VZVO-FALTUNG
UND
DIE
STABILITAET
DER
EXPRIMIERENDEN
ZELLEN
WIRD
VON
UNTERSCHIEDLICHEN
PUNKTMUTATIONEN
BEEINFLUSST
.
172
4.4.5.1
KOMBINATION
DER
VARIANTEN
HL
UND
H3
.
172
4.4.5.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
VARIANTEN
IN
VIVO
.
173
4.4.5.3
ZUSAMMENFASSUNG
.
178
4.4.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
VARIANTEN
IN
VITRO
.
180
4.4.6.1
THERMODYNAMISCHE
STABILITAET
.
180
4.4.6.2
THERMISCHE
DENATURIERUNG
.
182
4.4.6.3
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
RENATURIERUNG
VON
DENATURIERTEM
PROTEIN
.
185
4.4.7
ABHAENGIGKEIT
DER
ZELLSTABILITAET
VOM
FRAGMENT-TYP
.
189
4.4.7.1
SCFV-FRAGMENT
.
189
4.4.7.2
FAB-FRAGMENT
.
192
4.4.7.3
DSFV-FRAGMENT
.
196
4.4.8
DIE
IDENTIFIZIERTEN
POSITIONEN
ERKLAEREN
DAS
UNTERSCHIEDLICHE
VERHALTEN
DER
MODELL
ANTIKOERPER
HINREICHEND
.
198
4.4.8.1
VORUEBERLEGUNGEN
.
198
4.4.8.2
KONSTRUKTION
EINES
SYNTHETISCHEN
ANTIKOERPERS
MITTELS
LOOP-GRAFTING
.
200
4.4.8.3
CHARAKTERISIERUNG
IN
VIVO
.
205
5
DISKUSSION.
210
IV
5.1
ANTIKOERPER
AUS
ESCHERICHIA
COLI
ALS
MODELL
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
HETEROLOGEN
PROTEINEXPRESSION
.210
5.2
ALLGEMEINE
STRATEGIEN
ZUR
STEIGERUNG
DER
AUSBEUTE
.
211
5.3
DIE
COEXPRESSION
VON
FALTUNGSENZYMEN.
215
5.4
DIE
IDENTIFIZIERUNG
VON
FALTUNGSMUTATIONEN
.218
5.4.1
AGGREGATEN
IN
VITRO
.218
5.4.2
AGGREGATION
IN
VIVO
.220
5.4.3
PUNKTMUTATIONEN
VERHINDERN
DIE
AGGREGATEN
DES
MCPC603-ANTIKOERPERS
IN
VIVO
UND
IN
VITRO
.
224
5.5
PUNKTMUTATIONEN
IM
MCPC603-ANTIKOERPER
UNTERDRUECKEN
DIE
LEAKINESS
EXPRIMIERENDER
E.
COLI-ZTWEN.
231
5.6
LASSEN
SICH
DIE
IDENTIFIZIERTEN
FALTUNGSMUTATIONEN
VERALLGEMEINERN?
.
235
5.7
EIN
MODELL
ZUR
ANTIKOERPEREXPRESSION
.
237
5.8
AUSBLICK
.239
6
ZUSAMMENFASSUNG.
241
7
LITERATUR
.
_243
8
ANHANG
.
264
8.1
ABKUERZUNGEN
UND
SYMBOLE
.264
8.2
KONSTRUIERTE
VEKTOREN
.
265
8.3
GLOSSAR
.268 |
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