Rasterkraftmikroskopische Untersuchung des Chromatins:
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1994
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1.
EINLEITUNG
1
CHROMATIN
1
DIE
MORPHOLOGIE
DER
CHROMATINFASER
4
UNTERSUCHUNGEN
VON
TRANSKRIPTIONELL
AKTIVEM
CHROMATIN
8
TOPOLOGIE
DES
ZELLKERNS
9
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
VON
DNA
10
RASTERKRAFTMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
VON
CHROMATIN,
CHROMOSOMEN
UND
DNA
11
ZIELSETZUNG
DER
VORLIEGENDEN
ARBEIT
15
2.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
17
2.1.
MATERIALIEN
17
2.1.1.
CHEMIKALIEN
17
2.1.2.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
18
2.1.3.
BIOLOGISCHE
PROBEN
20
2.1.3.1.
HUEHNERBLUT
20
2.1.3.2.
ZELLINIEN
20
2.1.3.3.
POLYSOMEN
20
2.1.3.4.
TRANSKRIPTIONSKOMPLEXE
21
2.2.
METHODEN
21
2.2.1.
PRAEPARATION
VON
DNA
FUER
DIE
MIKROSKOPIE
21
2.2.1.1.
RELAXATION
SUPERHELIKALER
ZIRKULAERER
PLASMID-DNA
21
2.2.1.2.
DNA-PRAEPARATIONEN
FUER
DIE
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
21
2.2.1.2.1.
PROTEINSPREITUNGSTECHNIK
22
2.2.1.2.2.
MODIFIZIERTE
PROTEIN-SPREITUNGEN
22
2.2.1.2.3.
PROTEINFREIE
SPREITUNG
23
2.2.1.2.4.
AKTIVIERTE
KOHLEFILME
23
2.2.1.2.5.
ADSORPTION
AN
GLIMMER
24
2.2.1.3.
DNA-PRAEPARATION
FUER
DAS
RKM
24
2.2.2.
PRAEPARATION
VON
CHROMATIN
25
2.2.2.1.
CHROMATINSPREITUNG
AN
DER
PHASENGRENZFLAECHE
25
2.2.2.2.
ZENTRIFUGATION
NACH
MILLER
25
2.2.2.3.
SPREITUNG
DURCH
HYPOTONE
CHROMATINDISPERSION
26
2.2.2.3.1.
SPREITUNG
VON
ERYTHROZYTENCHROMATIN
26
2.2.2.3.2.
SPREITUNG
VON
DROSOPHILA-EMBRYONEN
27
2.2.2.3.3.
REKONSTITUIERTE
SUPRANUKLEOSOMALE
CHROMATINFASERN
27
2.2.2.4.
DETERGENSINDUZIERTE
SUPRANUKLEOSOMALE
FASERN
27
2.2.2.5.
DETERGENSFREI
PRAEPARIERTE
SUPRANUKLEOSOMALE
FASERN
27
2.2.2.6.
TROPFENDIFFUSIONSMETHODE
ZUR
CHROMATINSPREITUNG
28
2.2.2.7.
DETERGENSUNTERSTUETZTE
TROPFENDIFFUSION
28
2.2.2.S.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
VON
GESPREITETEM
CHROMATIN
28
2.2.2.9.
SDS-INDUZIERTE
ZELLYSE
29
2.2.3.
PRAEPARATION
VON
METAPHASECHROMOSOMEN
FUER
DIE
MIKROSKOPIE
29
2.2.3.1.
ANREICHERUNG
UND
SPREITEN
VON
METAPHASEZELLEN
29
2.2.3.2.
PRAEPARATION
ISOLIERTER
METAPHASECHROMOSOMEN
AUF
GLAS
29
2.2.3.3.
ISOLIERTE
CHROMOSOMEN
AUF
MEMBRANFILTER
30
2.2.3.4.
TROCKNUNG
NACH
DER
METHODE
DES
KRITISCHEN
PUNKTES
31
2.2.3.5.
GIEMSA-FAERBUNG
32
2.2.3.6.
ENZYMATISCHER
ABBAU
VON
CHROMOSOMEN
32
2.2.3.7.
UNTERSUCHUNG
VON
BEDECKTEN
CHROMOSOMEN
32
2.2.4.
DURCHLICHT
UND
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
33
2.2.4.1.
MIKROSKOPE
33
2.2.4.2.
FLUORESZENZFAERBUNG
MIT
DAPI
33
2.2.4.3.
FLUORESZENZFAERBUNG
MIT
YOYO
34
2.2.5.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
34
2.2.5.1.
GRIDS
MIT
KOLLODIUMFILM
34
2.2.5.2.
REPLIKA
VON
AN
GLIMMER
ADSORBIERTER
DNA
34
2.2.5.3.
CHROMATINPRAEPARATION
FUER
DAS
TEM
35
2.2.5.4.
TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE
(TEM)
35
2.2.5.5.
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE
(REM)
35
2.2.6.
ROENTGENMIKROSKOPIE
35
2.2.7.
RASTERSONDENMIKROSKOPIE
36
2.2.7.1.
RASTERTUNNELMIKROSKOP
37
2.2.7.2.
RASTERKRAFTMIKROSKOP
39
2.2.7.2.1.
PRINZIP
DES
RASTERKRAFTMIKROSKOPS
39
2.2.7.2.2.
KRAEFTE
IN
DER
RKM
41
2.2.7.2.3.
ELASTISCHE
VERFORMUNG
DER
PROBE
45
2.2.7.2.4.
BETRIEBSMODI
DES
RKM
49
2.2.7.2.5.
DER
EINFLUSS
DER
SPITZENGEOMETRIE
AUF
DIE
TOPOGRAPHIE
53
2.2.7.2.OE.
DIE
STRUKTURHOEHE
IM
RKM
55
2.2.7.2.7.
RASTERKRAFTMIKROSKOPISCHE
MESSUNGEN
56
2.2.7.3.
ANDERE
RASTERSONDENMIKROSKOPE
58
2.2.7.4.
OPTISCHE
NAHFELDMIKROSKOPIE
58
2.2.8.
BILDVERARBEITUNG
59
2.2.8.1
.
AUSWERTUNG
DER
RKM-DATEN
59
2.2.8.2.
VOLUMENBESTIMMUNG
AUS
RKM-DATEN
60
2.2.8.3.
VOLUMEN
JE
EINHEITSLAENGE
DER
CHROMATINFASER
65
2.2.8.4.
BESTIMMUNG
DER
ABSTAENDE
BENACHBARTER
NUKLEOSOMEN
IN
NUKLEOSOMALEN
KETTEN
65
2.2.8.5.
KONTURLAENGENMESSUNGEN
VON
DNA
65
2.2.8.6.
DIGITALISIERUNG
DER
TEM-AUFNAHMEN
66
3.
ERGEBNISSE
67
3.1.
DNA
67
3.1.1.
DIREKTADSORPTION
VON
DNA
AN
GLIMMER
67
3.2.
NUKLEOSOMALE
KETTEN
68
3.2.1.
DIE
PERLENKETTENSTRUKTUR
DES
CHROMATINS
IM
RKM
68
3.2.2.
DAS
VOLUMEN
DER
NUKLEOSOMALEN
KETTE
69
3.3.
CHROMATINFASERN
70
3.3.1.
HYPOTONE
SPREITUNG
VON
ERYTHROZYTENCHROMATIN
70
3.3.1.1.
SUPRANUKLEOSOMALE
FASERN
70
3.3.1.2.
DIE
NUKLEOSOMALE
KETTE
KONDENSIERT
BEI
ANSTIEG
DER
SALZKONZENTRATION
ZU
EINER
SUPRANUKLEOSOMALEN
FASER
71
3.3.1.3.
STAERKER
KONDENSIERTE
SUPRANUKLEOSOMALE
FASERN
DURCH
DETERGENSFREIE
PRAEPARATION
72
3.3.2.
HYPOTONE
SPREITUNG
DES
CHROMATINS
VON
DROSOPHILA
EMBRYONEN
73
3.3.3.
CHROMATINSPREITUNG
UNTER
ISOTONEN
BEDINGUNGEN
73
3.3.3.1
.
ISOTONE
LYSE
SPREITET
CHROMATIN
73
3.3.3.2.
DETERGENSSPREITUNG
INDUZIERT
MECHANISCHEN
STRESS
74
3.3.4.
CHROMATINSPREITUNG
AN
DER
PHASENGRENZFLAECHE
75
3.3.5.
DETERGENSINDUZIERTE
LYSE
ZERSTOERT
ZELLSTRUKTUR
75
3.3.6.
IN-SITU-HYBRIDISIERUNG
VON
GESPREITETEM
CHROMATIN
75
3.4.
DIE
STRUKTUR
VON
CHROMATIN
UNTER
FLUESSIGKEIT
76
3.4.1.
REHYDRATISIERTES
CHROMATIN
IST
IM
RKM
DARSTELLBAR
76
3.4.2.
EINE
AENDERUNG
DER
LONENSTAERKE
FUEHRT
ZU
REVERSIBLEN
VERAENDERUNGEN
IN
DER
MORPHOLOGIE
VON
GESPREITETEM
CHROMATIN
77
3.4.3.
RKM
UND
ROENTGENMIKROSKOPIE
ERMOEGLICHEN
UNTERSUCHUNGEN
AN
NATIV
HYDRATISIERTEM
UND
FIXIERTEM
CHROMATIN
77
3.5.
AKTIVES
CHROMATIN
IM
RKM
79
3.5.1.
RKM-DARSTELLUNG
DER
TRANSKRIPTION
CHROMOSOMALER
GENE
79
3.5.2.
EXTRACHROMOSOMALE
TRANSKRIPTIONSKOMPLEXE
IM
RKM
79
3.5.3.
TRANSLATIONSKOMPLEXE
IM
RKM
80
3.6.
METAPHASECHROMOSOM
81
3.6.1.
DIE
MORPHOLOGIE
VON
METAPHASESPREITEN
WIRD
IM
RKM
SICHTBAR
81
3.6.2.
TRITON
X-100
UND
TRYPSIN
BEWIRKEN
SELEKTIVEN
ABBAU
VON
SPREITSTRUKTUREN
82
3.6.3.
GIEMSA-FAERBUNG
83
3.6.4.
GOLDBEDAMPFTE
CHROMOSOMEN
ZEIGEN
STOERUNGEN
BEI
ABTASTUNG
IM
RKM
83
3.6.5.
MEMBRANFILTER
ALS
SUBSTRAT
FUER
CHROMOSOMENPRAEPARATION
84
3.6.6.
VOLUMENBESTIMMUNG
DES
DIPLOIDEN
CHROMOSOMENSATZES
85
3.6.7.
METAPHASECHROMOSOMEN
SCHWELLEN
BEI
REHYDRATISIERUNG
86
3.6.8.
HOEHE
UND
VOLUMEN
REHYDRATISIERTER
CHROMOSOMEN
89
3.6.9.
MANIPULATION
VON
METAPHASECHROMOSOMEN
IM
RKM
90
3.6.10.
ETHANOL
KONDENSIERT
REHYDRATISIERTE
CHROMOSOMEN
90
3.6.11.
KRAFT-ABSTANDSKURVEN
(KAK)
92
3.6.12.
FESTIGKEITSUNTERSUCHUNGEN
AN
DER
CHROMOSOMENSTRUKTUR
92
4.
DISKUSSION
95
4.1.
DNA
95
4.1.1.
URANYLAZETAT
STABILISIERT
AN
GLIMMER
ADSORBIERTE
DNA
95
4.1.2.
DIE
METROLOGIE
VON
DNA
IM
RKM
UND
IM
TEM
97
4.2.
NUKLEOSOMALE
KETTEN
98
4.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
CHROMATIN
IM
RKM
102
4.3.1.
FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN
AN
CHROMATIN
102
4.3.2.
DIE
SPREITUNG
NACH
ISOTONER
LYSE
ERHAELT
DIE
STRUKTURELLE
INTEGRITAET
DES
CHROMATINS
104
4.4.
CHROMATINFASERN
IM
RKM
104
4.4.1.
DER
QUERSCHNITT
UND
DAS
VOLUMEN
DER
CHROMATINFASER
109
4.4.2.
DIE
MORPHOLOGIE
VON
CHROMATINFASERN
111
4.5.
UNTERSUCHUNGEN
DER
CHROMATINSTRUKTUR
IN
FLUESSIGKEIT
113
4.5.1.
DIE
SUBSTRATBINDUNG
VON
CHROMATIN
NACH
DER
REHYDRATISIERUNG
IST
STABIL
113
4.5.2.
NATIV
HYDRATISIERTES
CHROMATIN
IM
RKM
UND
IM
ROENTGENMIKROSKOP
115
4.6.
TRANSKRIPTIONS
UND
TRANSLATIONSKOMPLEXE
IM
RKM
117
4.7.
METAPHASECHROMOSOMEN
IM
RKM
119
4.7.1.
RESTE
DER
ZELLMEMBRAN
UMGEBEN
GESPREITETE
CHROMOSOMEN
119
4.7.2.
TRITON
X-100
EXTRAHIERT
MEMBRANBESTANDTEILE
121
4.7.3.
HOEHE
VON
METAPHASECHROMOSOMEN
IM
RKM
122
4.7.4.
UNTERSUCHUNG
AN
CHROMOSOMEN,
DIE
AUS
ZELLEN
ISOLIERT
WURDEN
123
4.7.5.
ENZYMATISCHER
ABBAU
DER
CHROMOSOMENSTRUKTUR
IM
RKM
123
4.7.7.
REHYDRATISIERTE
CHROMOSOMEN
BESITZEN
EIN
ELASTISCHES
GRUNDGERUEST
127
4.7.8.
WECHSELWIRKUNGEN
ZWISCHEN
ABTASTSPITZE
UND
PROBE
IN
FLUESSIGKEIT
129
4.7.9.
ERMITTLUNG
DER
FEDERKONSTANTE
LOKALER
OBERFLAECHENSTRUKTUREN
130
5.
ZUSAMMENFASSUNG
137
6.
ANHANG
140
6.1.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
140
6.2.
LITERATUR
141 |
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