Proteine der Diatomeen-Zellwand: Primärstrukturen, Eigenschaften und mögliche Rolle bei der Zellwandbiogenese
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I-VI
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
VII-IX
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
2.1.
PFLANZENZELLWAENDE
3
2.2.
OEKONOMIE
UND
OEKOLOGIE
DER
DIATOMEEN
4
2.3.
BILDUNG
MINERALISIERTER
ZELLWAENDE
BEI
EINZELLERN
4
2.4.
AUFBAU
DER
DIATOMEEN-ZELLWAND
5
2.5.
BIOGENESE
DER
ZELLWAND
6
2.6.
AUSPRAEGUNG
DER
ARTSPEZIFISCHEN
ZELLWANDSTRUKTUR
6
2.6.1.
MAKROMORPHOGENESE
6
2.6.2.
MEMBRAN-VERMITTELTE
MORPHOGENESE
7
2.7.
AUFGABENSTELLUNG
9
3.
ERGEBNISSE
10
3.1.
ISOLIERUNG
DER
DIATOMEEN-ZELLWAND
10
3.2.
SEQUENTIELLE
EXTRAKTION
DER
ZELLWAENDE
10
3.3.
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
EDTA
EXTRAHIERBAREN
GLYKOPROTEINE
VON
C.
FUSIFORMIS
13
3.3.1.
GLYKOSYLIERUNG
13
3.3.2.
METALLIONEN-BINDUNG
14
3.3.2.I.
CALCIUM-ABHAENGIGE
PRAEZIPITATION
14
3.3.2.2.
CALCIUM-ABHAENGIGE
AENDERUNG
DER
MOBILITAET
BAE
SDS-PAGE
15
3.3.2.3.
CALCIUM-UEBERSCHICHTUNGSTEST
16
3.3.3.
DISULFID-BRUECKEN
16
3.3.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
MIT
H
14
COJ'
17
I
3.4.
DIE
75K
PROTEINE
19
3.4.1.
CHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNG
DER
75K
EDTA
KOMPONENTE
19
3.4.2.
AMINOSAEUREPARTIALSEQUENZEN
DER
75K
PROTEINE
21
3.4.3.
KLONIERUNG
EINER
75KCDNA
26
3.4.4.
PRIMAERSTRUKTUR
VON
P75KI
27
3.4.5.
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
P75KI
29
3.4.6.
GEWINNUNG
EINES
ANTISERUMS
GEGEN
DEN
ZWEITEN
TEIL
DERVORLAEUFERSEQUENZ
VON
P75KI
32
3.4.7.
AMINOSAEUREPARTIALSEQUENZEN
DER
MOK^^UND
DER
200KEDTA
KOMPONENTE
33
3.5.
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGEN
36
3.5.1.
GEWINNUNG
EINES
ANTISERUMS
GEGEN
P75KI
36
3.5.2.
IMMUNLOKALISATION
DER
EDTA-EXTRAHIERBAREN
GLYKOPROTEINE
36
3.5.3.
NACHWEIS
VON
P75KI
HOMOLOGEN
ZELLWANDPROTEINEN
BEI
ANDEREN
DIATOMEENARTEN
38
3.6.
KLONIERUNG
VON
ZUR
75KI
CDNA
HOMOLOGEN
GENEN
40
3.6.1.
AUFSTELLEN
EINER
GENOMISCHEN
DNA-BANK
VON
C.
FUSIFORMIS
40
3.6.2.
DURCHSUCHEN
DER
GENBANK
MIT
EINER
75KI
CDNA
SPEZIFISCHEN
SONDE
40
3.6.3.
KLONIERUNG
DER
GENE
G75KII
UND
G75KUI
41
3.6.4.
KLONIERUNG
EINER
ZUR
75KI CDNA
HOMOLOGEN,
GENOMISCHEN
DNA-SEQUENZ
AUS
N.
PELLICULOSA
45
3.6.5.
VERGLEICH
DER
EXON-INTRON-STRUKTUREN
VON
G75KII,
G75KIII
UND
G36K
47
3.7.
ANREICHERUNG
UND
PARTIELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
200
KDA
PROTEINS
AUS
DEM
HF-EXTRAKT
DER
C
FUSIFORMIS
ZELLWAND
50
3.7.1.
AUFTRENNUNG
DER
PROTEINE
DES
HF-EXTRAKTES
50
3.7.2.
ERMITTLUNG
VON
AMINOSAEURE-PARTIALSEQUENZEN
DES
200K
HF
PROTEINS
51
3.7.3.
KLONIERUNG
DES
3'-BEREICHES
DES
FUER
DAS
200K
HF
PROTEIN
CODIERENDEN
GENS
(G200K
HF
)
52
4.
DISKUSSION
55
4.1.
DIE
ACR-PROTEINFAMILIE
55
4.2.
STRUKTURELLE
CHARAKTERISTIKA
DER
ZELLWANDPROTEINE
56
4.3.
TRANSPORT
DER
ACR-PROTEINE
IN
DIE
ZELLWAND
58
N
4.4.
CA
2+
-AEFFINITAET
60
4.5.
HYPOTHESEN
ZUR
FUNKTION
DER
DIATOMEEN-ZELLWANDPROTEINE
60
4.5.1.
STRUKTURKOMPONENTEN
60
4.5.2.
MORPHOGENETISCHE
FAKTOREN
61
5.
MATERIAL
UND
METHODEN
64
5.1.
KULTURHALTUNG
64
5.1.1.
STAMMKULTURHALTUNG
66
5.1.2.
ANZUCHT
FUER
ANALYTISCHE
ZWECKE
66
5.1.3.
ANZUCHT
FUER
PRAEPARATIVE
ZWECKE
66
5.1.4
SYNCHRONISATION
DER
ZELLTEILUNG
66
5.2.
ISOLIERUNG
DER
DIATOMEEN-ZELLWAND
67
5.2.1
ISOLIERUNG
DER
ZELLWAND
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
67
5.2.2.
ISOLIERUNG
DER
ZELLWAND
IM
HALBPRAEPARATIVEN
MASSSTAB
68
5.2.3.
ISOLIERUNG
DER
ZELLWAND
IM
PRAEPARATIVEN
MASSSTAB
68
5.3.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
68
5.3.1.
SEQUENTIELLE
EXTRAKTION
DER
GEREINIGTEN
ZELLWAENDE
68
5.3.1.1.
EDTA-EXTRAKTION
68
5.3.1.2.
SDS-EXTRAKTION
69
5.3.1.3.
HF-EXTRAKTION
69
5.3.2.
REINIGUNG
DER
75K
GLYKOPROTEINE
DES
EDTA-EXTRAKTES
VON
C.
FUSIFORMIS
70
5.3.3.
REINIGUNG
DER
140K
EDTA
UND
DER
200K
EDTA
KOMPONENTEN
C.
FUSIFORMIS
70
5.3.4.
ANREICHERUNG
DER
200K
HF
UND
155K
HF
PROTEINE
71
5.3.6.
TRYPTISCHER
VERDAU
VON
PROTEINEN
IM
POLYACIYLAMIDGEL
72
5.3.7.
TRANSFER
EINES
PROTEINS
AUF
EINE
PVDF-MEMBRAN
ZUR
ANSEQUENZIERUNG
DES
N-TERMINUS
73
5.3.8.
PEPTIDTRENNUNG
DURCH
REVERSED-PHASE-HPLC
73
5.3.9.
SYNTHESE
EINES
PEPTID-ANTIGENS
74
5.3.9.1.
PEPTIDSYNTHESE
74
5.3.9.2.
REINIGUNG
DES
SYNTHETISCHEN
PEPTIDS
76
5.3.9.3.
KOPPLUNG DES
PEPTIDS
AN
PROTEINE
76
5.3.10.
DEGLYKOSYLIERUNG
MITTELS
FLUORWASSERSTOFF
77
5.3.11.
45
CA
2+
-UEBERSCHICHTUNGSTEST
77
5.3.12.
CA
2+
-ABHAENGIGE
PRAEZIPITATION
DER
KOMPONENTEN
DES
EDTA-EXTRAKTES
78
5.3.13.
CA
2+
-ABHAENGIGE
MOBILITAETSAENDERUNG
DER
75K
PROTEINE
BEI
SDS-PAGE
78
5.3.14.
REINIGUNG
DES
EXPRESSIONSPRODUKTES
P75KI
78
5.4.
ZUCKERCHEMISCHE
METHODEN
80
5.4.1.
PRAEPARATION
DER
14
C-MARKIERTEN
75K
ED
TA
KOMPONENTE
80
5.4.2.
TOTALHYDROLYSE
DER
OLIGOSACCHARID-KETTEN
80
5.4.3.
REDUKTION
DER
MONOSACCHARIDE
MIT
NABH
4
81
5.4.4.
DERIVATISIERUNG
DER
MONOSACCHARIDE
ZU
ALDITOLACETATEN
81
5.4.5.
GASCHROMATOGRAPHISCHE
AUFTRENNUNG
DER
ALDITOLACETATE
81
5.4.6.
ZUCKERBESTIMMUNG
NACH
DER
PHENOL/SCHWEFELSAEURE
METHODE
82
5.5.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
82
5.5.1.
IMMUNISIERUNG
EINES
KANINCHENS
MIT
P75KI
UND
GEWINNUNG
DES
ANTISERUMS
82
5.5.2.
IMMUNISIERUNG
EINES
HUHNS
MIT
DEM
KLH-CSPUE-KONJUGAT
82
5.5.3.
REINIGUNG
DER
IGG-FRAKTION
DES
KANINCHENSERUMS
UEBER
CHROMATOGRAPHIE
AN
PROTEIN
G
83
5.5.4.
PRAEPARATION
DER
ANTIKOERPERFRAKTION
AUS
EINEM
HUEHNEREI
83
5.5.5.
WESTERN
BLOTTING
84
5.5.5.1.
PROTEINTRANSFER
MITTELS
KONTINUIERLICHEM
PUFFERSYSTEM
84
5.5.5.2.
PROTEINTRANSFER
MITTELS
DISKONTINUIERLICHEM
PUFFERSYSTEM
84
5.5.5.3.
IMMUNODETEKTION
MITTELS
FARBREAKTION
85
5.5.5.4.
IMMUNDETEKTION
MITTELS
CHEMOLUMINESZENZ
85
5.5.6.
IMMUNELEKTRONENMIKROSKOPIE
86
5.6.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
BCA-METHODE
87
5.7.
BIOCHEMISCHE
STANDARDMETHODEN
87
5.7.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
88
5.7.1.
BAKTERIENSTAEMME
88
5.7.2.
MEDIEN
88
5.7.3.
PUFFER
89
5.7.4.
STANDARDMETHODEN
93
5.7.5.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
AUS
C.
FUSIFORMIS
94
5.7.6.
PRAEPARATION
VON
ROHER
GENOMISCHER
DNA
AUS
N.
PELLICULOSA
FUER
DIE
PCR
94
5.7.7.
PRAEPARATION
VON
RNA
AUS
C.
FUSIFORMIS
95
5.7.8.
SYNTHESE
EINER
C.
FUSIFORM
IS-CDNA-BANK
AN
MAGNETISCHEN
KUEGELCHEN
96
5.7.9.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
96
5.7.9.1.
PRAEPARATION
VON
PLASMID-VEKTOREN
96
IV
5.7.10.
RESTRIKTIONSVERDAU
VON
DNA
97
5.7.11.
LIGATION
VON
DNA-MOLEKUELEN
MIT
PLASMID-VEKTOREN
97
5.7.12.
TRANSFORMATION
97
5.7.12.1.
ERZEUGUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
ZELLEN
97
5.7.13.
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
98
5.7.13.1.
PCR
MIT
GENOMISCHER
DNA
98
5.7.13.2.
RT-PCR
99
5.7.13.3.
3-RACE-PCR
100
5.7.13.4.
5-RACE-PCR
101
5.7.13.5.
KOLONIE-PCR
101
5.7.14.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
101
5.7.15.
SYNTHESE
RADIOAKTIV
MARKIERTER
DNA
102
5.7.15.1.
SYNTHESE
VON
DNA-SONDEN
102
5.7.15.2.
RADIOMARKIERUNG
VON
AHINDLLL-DNA
103
5.7.16.
AUFSTELLEN
EINER
GENOMISCHEN
GENBANK
VON
C.
FIISIFORMIS
103
5.7.16.1.
PRAEPARATION
VON
PLATING
BAKTERIEN
103
5.7.16.2.
PARTIELLER
SAU3
AL-VERDAU
DER
GENOMISCHEN
DNA
104
5.7.16.3.
LIGATION
DER
PARTIALVERDAUTEN
GENOMISCHEN
DNA
MIT
DER
VEKTOR-DNA
104
5.7.16.4.
VERPACKUNG
DER
HYBRID-DNA
ZU
REKOMBINANTEN
PHAGEN
104
5.7.16.5.
AMPLIFIKATION
DER
PRIMAEREN
GENBANK
105
5.7.17.
DURCHSUCHEN
DER
GENOMISCHEN
XEMBL3
GENBANK
MIT
EINER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
DNA-SONDE
105
5.7.18.
ANREICHERUNG
DER
PHAGEN-DNA
106
5.7.19.
SOUTHERN
BLOT
107
5.7.20.
KLONIERUNG
UND
EXPRESSION
VON
CDNA
SEQUENZEN
MITTELS
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
PET
11A
107
5.7.20.1.
KLONIERUNG
DER
75KI
CDNA
IN
PETL
LA
107
5.7.20.2.
TESTEXPRESSION
108
5.7.21.
SYNTHESE
UND
BEZUG
VON
OLIGONUCLEOTIDEN
108
5.7.22.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
109
5.7.23.
ERZEUGUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
MITTELS
EXONUCLEASELUE
109
5.8.
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
MATERIALIEN
111
5.9.
LABORGERAETE
113
6.
DNA-SEQUENZEN
117
6.1.
SEQUENZ
DER
75KI
CDNA
117
6.2.
SEQUENZ
DES
2,3
KB
PSTL-FRAGMENTES
VON
AE5A-3
119
6.3.
SEQUENZ
DES
3'-BEREICHS
DER
75KUI
CDNA
121
6.4.
SEQUENZ
DES
1,5
KB PSTL-FRAGMENTES
VON
X5A-3
122
6.5.
SEQUENZ
DES
3,2
PSTL-FRAGMENTES
VON
15A-3
124
6.6.
SEQUENZ
DES
G36K
GENS
127
7.
LITERATURVERZEICHNIS
129 |
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