Nachweis spezifischer zellulärer Immunitätsmechanismen, insbesondere zytotoxischer T-Zellen, bei der Bovinen Virusdiarrhoe:
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1995
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I
1
EINLEITUNG
1
2
SCHRIFTTUM
2
2.1
ZELLULAERE
SEITE
DER
SPEZIFISCHEN
IMMUNANTWORT
2
2.1.1
LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN
2
2.1.1.1
UNTERTEILUNG
IN
B
UND
T-LYMPHOZYTEN
SOWIE
"NULLZELLEN"
2
2.1.1.2
LYMPHOZYTENDIFFERENZIERUNGSMARKER
3
2.1.2
DER
HAUPTHISTOKOMPATIBILITAETSKOMPLEX
(MAJOR
HISTOCOMPATIBILITY
7
COMPLEX
-
MHC)
2.1.2.1
MHC-KLASSE
I
8
2.1.2.2
MHC-KLASSE
11
10
2.1.3
DER
T-ZELLREZEPTOR
13
2.1.4
PRAESENTATION
VON
ANTIGENEN
UND
IHRE
SPEZIFISCHE
ERKENNUNG
UND
16
ELIMINATION
DURCH
T-ZELLEN
2.1.4.1
T-HELFERZELLEN
(TH)
16
2.1.4.2
ZYTOTOXISCHE
T-ZELLEN
(CTL)
17
2.1.4.3
NATUERLICHE
KILLERZELLEN
(NK-ZELLEN)
21
2.2
NACHWEIS
ZYTOTOXISCHER
T-ZELLEN
BEIM
RIND
21
3
MATERIAL
UND
METHODEN
24
3.1
TIERE
UND
IMMUNISIERUNG
24
3.1.1
TIERGRUPPEN
24
3.1.2
LEBENDVIRUS
FUER
TESTINFEKTIONEN
27
3.1.3
PROBENENTNAHME,
BEARBEITUNG
UND
LAGERUNG
27
3.2
HERSTELLUNG
VON
VIRUSMATERIAL
28
3.2.1
ZELLKULTUR
28
3.2
2
VIRUSVERMEHRUNG
MIT
BOVINEN
EMBRYONALEN
LUNGENZELLEN
(BEL)
29
3.2.3
VIRUSKONZENTRIERUNG
MITTELS
POLYETHYLENGLYKOL
(PEG)
29
3.2.4
KONTROLL-ZELLKULTUNIBERSTAENDE
(MOCK)
30
3.2.5
VIRUSTITERBESTIMMUNG
30
3.3
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
ZUR
LYMPHOZYTENPHAENO
30
TYPISIERUNG
3.3.1
HYBRIDOME
UND
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
(MAK)
30
3.3.2
HYBRIDOMKULTIVIERUNG
31
3.3.3
AUFREINIGUNG
UND
MARKIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
32
II
3.4
ISOLIERUNG
VON
LEUKOZYTEN
AUS
DEM
PERIPHEREN
BLUT
33
3.4.1
AMMONIUMCHLORIDLYSE
33
3.4.2
DICHTEZENTRIFUGATION
33
3.4.3
ZAEHLUNG
UND
DIFFERENZIERUNG
DER
BLUTZELLPOPULATIONEN
34
3.5
DARSTELLUNG
VON
OBERFLAECHENANTIGENEN
UND
INTRAZELLU
36
LAEREN
ANTIGENEN
3.5.1
INDIREKTE
INUNUNFLUORESZENZFAERBUNG
VON
OBERFLAECHENANTIGENEN
36
3.5.2
INDIREKTE
INUNUNFLUORESZENZFAERBUNG
INTRAZELLULAERER
ANTIGENE
38
3.6
NACHWEIS
BVD-SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
38
3.6.1
ENZYMATISCHER
NACHWEIS
(ELISA)
39
3.6.2
SERUMNEUTRALISATIONSTEST
(SNT)
39
3.7
PROBENERFASSUNG
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
40
3.7.1
MESSTECHNIK
40
3.7.2
ERFASSUNG
UND
AUSWERTUNG
DER
INDIREKTEN
INUNUNFLUORESZENZ
IM
42
DURCHFLUSSZYTOMETER
3.8
MAGNETISCHE
SEPARATION
VON
LYMPHOZYTENSUB
45
POPULATIONEN
3.9
BLASTENTRANSFORMATIONS-TEST
46
3.10
STIMULATIONSPROTOKOLLE
FUER
BOVINE
LYMPHOZYTEN
49
3.11
ZYTOTOXIZITAETS-TEST
52
3.11.1
ZIELZELLEN
(TARGETZELLEN,
TARGETS)
52
3.11.2
EFFEKTORZELLEN
52
3.11.3
KONDITIONIERTE
MEDIEN
UND
REKOMBINANTES
INTERLEUKIN-2
52
3.11.4
PROTOKOLL
DES
ZYTOTOXIZITAETS-TESTS
(CTL-TEST)
53
4
ERGEBNISSE
56
4.1
BVD-VIRUSISOLIERUNG
UND
SEROKONVERSION
DER
VERSUCHS
56
RINDER
NACH
TESTINFEKTION
4.1.1
VIRUSISOLIERUNG
56
4.1.2
SEROKONVERSION
DER
VERSUCHSRINDER
NACH
TESTINFEKTION
59
4.2
VERAENDERUNG
DER
ANZAHL
VON
GESAMTLEUKOZYTEN,
61
GRANULOZYTEN,
LYMPHOZYTEN
SOWIE
EINZELNER
LYMPHO
ZYTENSUBPOPULATIONEN
IM
PERIPHEREN
BLUT
VON
IMMUNI
SIERTEN
UND
SERONEGATIVEN,
NAIVEN
RINDERN
NACH
INTRA
NASALER
INFEKTION
MIT
DEM
BVD-VIRUSISOLAT
PT810
4.2.1
GEMEINSAME
BETRACHTUNG
VON
VIRUSISOLIERUNG,
SEROLOGIE
UND
65
VERAENDERUNG
DER
LYMPHOZYTENSUBPOPULATIONEN
NACH
TESTINFEKTION
III
4.3
RESTIMULATION
VON
LYMPHOZYTEN
AUSGEWAEHLTER,
IMMUN
67
ISIERTER
ODER
NAIVER
RINDER
MIT DEM
BVD-VIRUSISOLAT
PT810
4.3.1
LYMPHOZYTENTRANSFORMATION
BEI
AUSGEWAEHLTEN
IMMUNISIERTEN
UND
67
NAIVEN
RINDERN
4.3.2
EXPRESSION
VON
OBERFLAECHENMARKEM
UND
AKTIVIERUNGSANTIGENEN
78
NACH
RESTIMULATION
4.3.3
IN
VIFRO-PRODUKTION
BVDV-SPEZIFISCHER
NEUTRALISIERENDER
84
ANTIKOERPER
4.4
BVDV-SPEZIFISCHE
ZYTOTOXISCHE
T-ZELLEN
BEI
IMMUN
85
ISIERTEN
RINDERN
4.4.1
MESSUNG
DER
ZYTOTOXIZITAET
IM
DURCHFLUDZYTOMETER
85
4.4.2
ALLOGENE
STIMULATION
BOVINER
LYMPHOZYTEN
MIT
INAKTIVIERTEN
BL-3
90
LYMPHOMZELLEN
4.4.3
RESTIMULATION
BOVINER
LYMPHOZYTEN
MIT
DEM
BVD-VIRUSISOLAT
91
PT810
ZUR
GENERIERUNG
ZYTOTOXISCHER
T-ZELLEN
(CTL;
EFFEKTORZELLEN)
4.4.4
EX
VRVO-NACHWEIS
ZYTOTOXISCHER
LYMPHOZYTEN
AUS
DEM
PERIPHEREN
96
BLUT
VON
RINDERN
IN
DEN
ERSTEN
4
WOCHEN
NACH
INTRANASALER
B
VD
V
-T
ESTINFEKTION
4.4.5
NACHWEIS
BVDV-SPEZIFISCHER
ZYTOTOXISCHER
T-ZELLEN
BEI
DEN
98
RINDERN
KOKO,
OLGA
UND
WALLI
(IN
VITRO)
4.4.6
MHC-RESTRIKTION
DER
BVDV-SPEZIFISCHEN
ZYTOTOXISCHEN
T-ZELLEN
104
DER
TIERE
KOKO
UND
OLGA
5
BESPRECHUNG
DER
ERGEBNISSE
106
5.1
VIRUSISOLIERUNG,
LEUKOZYTEN
UND
LYMPHOZYTEN
106
POPULATIONEN,
BVDV-SPEZIFISCHE
SEROLOGIE
P
INF.
5.2
BVDV-SPEZIFISCHE
ZELLULAERE
IMMUNITAET
108
6
ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY
116
7
LITERATURVERZEICHNIS
118
8
ANHANG
134
8.1
MATERIALLISTE
134
8.2
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
138 |
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