Regulation der Expression, Funktion und Internalisierung von muscarinischen Acetylcholinrezeptoren:
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1995
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MUSCARINISCHEN ACETYLCHOLINREZEPTOREN INAUGURAL-DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE IM FACHBEREICH PHARMAZIE DER FREIEN
UNIVERSITAET BERLIN VORGELEGT VON * WOLFGANG LENZ AUS TRABEN-TRARBACH
BERLIN 1995 INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS I 1. VERWENDETE
ABKUERZUNGEN 1 2. ZUSAMMENFASSUNG 4 3. EINLEITUNG 9 3.1 SIGNALUEBERTRAGUNG
9 3.2 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN 10 3.3 SIGNALTRANSDUKTION DURCH
G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN 14 3.4 FAMILIE UND STRUKTUR
HETEROTRIMERER G-PROTEINE 15 3.5 FUNKTIONSWEISE DER G-PROTEINE 18 3.6
ACETYLCHOLINREZEPTOREN 20 3.7 MUSCARINISCHE ACETYLCHOLINREZEPTOREN 21
3.7.1 BEDEUTUNG DER MACHR FUER DEN ORGANISMUS .-. 21 3.7.2 REINIGUNG UND
KLONIERUNG DER MUSCARINREZEPTOREN 21 3.7.3 FUNKTION UND VERTEILUNG DER
MUSCARINREZEPTOR-SUBTYPEN 22 3.7.4 STRUKTURVERGLEICH DER
MUSCARINREZEPTOR-SUBTYPEN 24 3.8. DESENSIBUEISIERUNG VON
G-PROTEIN-GEKOPPELTEN REZEPTOREN 27 3.9 FRAGESTELLUNG 31 4. MATERIAL UND
METHODEN 33 4.1 MATERIAL 33 4.1.1 CHEMIKALIEN 33 4.1.2 RADIOAKTIVE
CHEMIKALIEN 37 4.1.3 ENZYME 38 4.2 METHODEN 39 4.2.1
MACHR-LIGANDBINDUNGSVERSUCHE 39 INHALTSVERZEICHNIS 4.2.1.1 [ 3
H]-QNB-BINDUNGSASSAY AN MEMBRANHOMOGENATEN 39 4.2.1.2 [ 3
H]-QNB-SAETTIGUNGSVERSUCHE ZUR BESTIMMUNG DER REZEPTORAFFINITAET FUER[ 3
H]-QNB 41 4.2.1.3 [ 3 H]-QNB-CARBACHOL-KOMPETITIONSVERSUCHE 42 4.2.1.4 [
3 H]-NMS-BINDUNGSASSAY AN INTAKTEN ZELLEN 43 4.2.1.5 BESTIMMUNG DER
SUBZELLULAEREN VERTEILUNG DER MACHR 44 4.2.2 PROTEINBESTIMMUNG VON
MEMBRANPROTEINEN 44 4.2.3 ZELLKULTUR 45 4.2.4 MESSUNG DER MACHR-MRNA
DURCH LOESUNGSHYBRIDISIERUNG 46 4.2.4.1 ISOLATION VON RNA AUS
ZELLKULTUREN 47 4.2.4.2 BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION 49 4.2.4.3
SYNTHESE DER RNA-SONDEN 49 4.2.4.4 REINIGUNG DER RNA-SONDEN 51 4.2.4.5
RNA/RNA-LOESUNGSHYBRIDISIERUNGSASSAY 51 4.2.5 RNASE-PROTEKTIONSANALYSE
AUF HARNSTOFF/POLYACRYLAMIDGELEN 53 4.2.6 UNTERSUCHUNG DER MACHR-MRNA
DURCH NORTHERN-ANALYSE 54 4.2.6.1 ISOLATION VON POLY(A) + RNA .-. 54
4.2.6.2 FORMALDEHYD-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 55 4.2.6.3 NORTHERN BLOT 56
4.2.6.4 SYNTHESE DER DNA-SONDE DURCH POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 57
4.2.6.5 NORTHERN-HYBRIDISIERUNG 58 4.2.7 AUTORADIOGRAPHIE 59 4.2.8
MESSUNG DER [ 3 H]-URIDIN- UND [ 3 H]-LEUCIN-INKORPORIERUNG 59 4.2.9
MESSUNG DER MACHR-VERMITTELTEN HEMMUNG DER DURCH FORSKOLIN STIMULIERTEN
CAMP-AKKUMULATION IN INTAKTEN ZELLEN 60 4.2.10 BESTIMMUNG DER
REZEPTOR-STIMULIERTEN GTP-HYDROLYSE 62 4.2.10.1 MEMBRANPRAEPARATION FUER
GTPASE-ASSAY 62 4.2.10.2 BESTIMMUNG DER GTPASE-AKTIVITAET 64 4.2.11
BESTIMMUNG DER MACHR-VERMITTELTEN PHOSPHOLIPASE C-STIMULATION 65 4.2.12
BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DER PROTEINKINASE A (PKA) 66 4.2.13 PRAEPARATION
VON DNA 67 4.2.13.1 BAKTERIENKULTUR 67 INHALTSVERZEICHNIS 4.2.13.2
REINIGUNG UND PRAEZIPITATION VON DNA 67 4.2.13.3 REINIGUNG VON
SYNTHETISCHEN OLIGONUCLEOTIDEN 68 4.2.13.4 BESTIMMUNG DER
DNA-KONZENTRATION 69 4.2.13.5 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS 1-2 ML
BAKTERIENKULTUREN 69 4.2.13.6 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS 25-50 ML
BAKTERIENKULTUREN 70 4.2.13.7 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS 500 ML
BAKTERIENKULTUREN 71 4.2.13.8 PRAEPARATION DER EINZELSTRAENGIGEN FORM DER
M13-BAKTERIOPHAGEN-DNA 72 4.2.14 MANIPULATION VON DNA 73 4.2.14.1
RESTRIKTIONSENZYMBEHANDLUNG VON DNA 73 4.2.14.2
AUFIUELLREAKTIONVONDNA-5-UEBERHANGENDEN 73 4.2.14.3 PHOSPHORYLIERUNG VON
SYNTHETISCHEN DNA-LINKERN 73 4.2.14.4
DEPHOSPHORYLIERUNGVONDNA-5-PHOSPHATENDEN 74 4.2.14.5 ISOLATION VON
DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 74 4.2.14.6 LIGATION , 75 4.2.15 ANALYSE
VON DNA UND RNA 76 4.2.15.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 76 4.2.15.2
POLYACRYLAMIDGELEKTROPHORESE 76 4.2.15.3 SEQUENZIERUNG VON DNA 78 4.2.16
EINFUHREN VON DNA IN BAKTERIENZELLEN 79 4.2.16.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER
BAKTERIEN 79 4.2.16.2 TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN 80 4.2.17
VEKTOR-KONSTRUKTION UND EXPRESSION DES WT- UND DER MUTIERTEN MACHR IN
CHO-ZELLEN 80 4.2.17.1 VEKTOR-KONSTRUKTION DURCH DELETIONSMUTAGENESE 80
4.2.17.2 VEKTOR-KONSTRUKTION MIT HILFE GERICHTETER MUTAGENESE 81
4.2.17.3 TRANSFEKTION VON DNA IN EUKARYOTISCHE ZELLEN 85 4.2.17.4
ISOLATION EINZELNER G418-RESISTENTERZELLKLONE 86 4.2.18
PERMEABILISIERUNG VON MDCK-ZELLEN MIT STREPTOLYSIN-0 87 4.2.19
GTP[YS]-BINDUNGSASSAY 88 4.2.20 PRAEPARATION VON CYTOSOL AUS RATTENHIRN
89 III INHALTSVERZEICHNIS 5. ERGEBNISSE 90 5.1 DOWNREGULATION DER
M4-MUSCARINREZEPTOREN IN N1E-115 UND ATT-20-ZELLEN 90 5.2 BETEILIGUNG
DER REZEPTOR-INTERNALISIERUNG AN DER DESENSIBILISIERUNG VON
M4-MUSCARINREZEPTOREN 108 5.3 ROLLE DER REZEPTOR-G-PROTEIN-INTERAKTION
FUER DIE INTERNALISIERUNG VON MUSCARINREZEPTOREN 114 5.4 INTERNALISIERUNG
VON MUSCARINREZEPTOREN IN PERMEABILISIERTEN MDCK-ZELLEN 126 5.5
BEDEUTUNG MEMBRAN-PROXIMAL LOKALISIERTER THREONIN-RESTE FUER DIE
INTERNALISIERUNG VON MUSCARINREZEPTOREN 134 6. DISKUSSION 147 6.1
REGULATION DER DURCH G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN VERMITTELTEN
SIGNALTRANSDUKTION R 147 6.2 REGULATION DER
MUSCARINREZEPTOR-GENEXPRESSION IN N1E-115 UND ATT-20-ZELLEN 147 6.3
BETEILIGUNG DER REZEPTOR-INTERNALISIERUNG AN DER DESENSIBILISIERUNG VON
MUSCARINREZEPTOREN 150 6.4 ROLLE DER AKTIVIERUNG HETEROTRIMERER
G-PROTEINE FUER DIE INTERNALISIERUNG VON MUSCARINREZEPTOREN 153 6.5
INTERNALISIERUNG VON MUSCARINREZEPTOREN IN PERMEABILISIERTEN MDCK-ZELLEN
156 6.6 BEDEUTUNG MEMBRAN-PROXIMAL LOKALISIERTER THREONIN-RESTE FUER
DIE INTERNALISIERUNG VON MUSCARINREZEPTOREN 159 6.7 BEDEUTUNG UND
REGULATION DER DOWNREGULATION UND INTERNALISIERUNG VON
MUSCARINREZEPTOREN 165 IV INHALTSVERZEICHNIS 7. LITERATURVERZEICHNIS 167
ABSTRACT 183 EIGENE PUBLIKATIONEN 184 LEBENSLAUF 186
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