Isolierung und Charakterisierung eines Schlüsselgens aus dem Biosyntheseweg der Sexual-Pheromone der Zygomyceten:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1995
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INHALT
SEITE
1.
SEXUAL-PHEROMONE
IN
PILZEN
-
EINE
UEBERSICHT
1
1.1.
PILZLICHE
GAMONE
UND
IHRE
WIRKUNG
4
1.1
1.
SIRENIN
DAS
GARNON
AUS
ALLOMYCES
6
1.1.2.
ANTHERIDIOL
UND
OOGONIOL:
DIE
GAMONE
AUS
ACHLYA
7
1.1.3
TRISPORSAURE
UND
DEREN
VORSTUFEN:
DIE
GAMONE
AUS
ZYGOMYCETEN
8
1.1.4.
PEPTIDGAMONE
AUS
ASCOMYCETEN
11
1
1
5
PEPTIDGAMONE
AUS
BASIDIOMYCETEN
14
1.2.
REGULATION
DER
GAMONAUSSCHUETTUNG
UND-ANTWORT
17
2.
EINFUEHRUNG
ZUM
PRAKTISCHEN
TEIL
22
2.1.
DIE
TRISPORSAEURE-BIOSYNTHESE
IN
ZYGOMYCETEN
22
2.2.
EINORDNUNG
UND
ZIEL
DIESER
ARBEIT
23
3.
MATERIAL
26
3
1
MIKROORGANISMEN
26
3.1.1.
ZYGOMYCETENSTAEMME
26
3.12.
BAKTERIEN
UND
VEKTOREN
26
3.2.
GERAETE
26
3.3.
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
HILFSMITTEL
27
3.4.
PRIMERSEQUENZEN
27
4.
METHODEN
29
4.1.
MEDIEN
UND
KULTIVIERUNG
29
4.1.1.
MEDIEN
29
4.1.2.
BAKTERIEN
29
4.1
3.
ZYGOMYCETEN
29
4.2.
ISOLIERUNG
DER
4-DIHYDROMETHYL-TRISPORAT(P*)-DEHYDROGENASE
AUS
MUCOR
MUCEDO
30
4.2.1.
ISOLIERUNG
AUS
SUBMERSKULTUREN
30
4.2.2.
ISOLIERUNG
AUS
EMERSKULTUREN
30
4.3
ISOLIERUNG
UND
ANALYSE
DER
GAMONE
DER
ZYGOMYCETEN
31
4.3.1.
TRISPORSAEUREISOLIERUNG
AUS
BLAKESLEA
TRISPORA
31
4.3
2.
CHEMISCHE
UMWANDLUNG
VON
TRISPORSAEURE
IN
4-DIHYDROMETHYL-
TRISPORAT
32
4.3
3.
ZYGOPHORENINDUKTION
DURCH
GAMONE
(BIO-ASSAY)
33
SEITE
4
3.4.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
33
4.4.
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
DER
P
+
-DEHYDROGENASE
33
4
4.1.
PHOTOMETRISCHE
AKTIVITAETSBESTIMMUNG
33
4.4.2.
AKTIVITAETSFAERBUNG
IN
POLYACRYLAMID-GELEN
(PAA-GELEN)
35
4.4.3.
ANALYSE
DES
SUBSTRATABBAUS
36
4.5.
PROTEINBESTIMMUNG
IN
ENZYMLOESUNGEN
36
4.5.1.
BCA-METHODE
36
4.5.2.
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNGSMETHODEN
36
4.6.
REINIGUNG
DER
P
+
-DEHYDROGENASE
37
4.6
1.
ULTRAFILTRATION
37
4.6.2.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
37
4.6.3.
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
38
4.6.4.
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
38
4.7.
GELELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
FUER
PROTEINE
40
4.7.1.
SDS
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
40
4.7.2.
NATIVE
PAGE
40
4.7.3.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
40
4.7.4.
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
IN
PAA-GELEN
UND
RENATURIERUNG
41
4.8.
TRANSFER
UND
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AN
PVDF-MEMBRANEN
41
4.9.
SEQUENZIERUNG
VON
PROTEINEN
AN
PVDF-MEMBRANEN
42
4.9.1.
ENZYMATISCHE
SPALTUNG
VON
PROTEINEN
UND
HPLC-AUFTRENNUNG
GENERIERTER
PEPTIDE
42
4.9.2.
SEQUENZIERUNG
VON
PROTEINEN
UND
PEPTIDEN
43
4.10.
GRUNDMETHODEN
DER
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
43
4.10.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUS
ZYGOMYCETEN
43
4.10.2.
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
44
4.10.3.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AN
NYLON-MEMBRANEN
45
4.10.4.
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN
UND
YYNORTHEM"-BLOTS
45
4.10.5.
KLONIERUNG
VON
DNA
IN
ESCHERICHIA
COLI
45
4.10.6.
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
45
4.11.
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
DIE
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
46
4.11.1.
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
46
SEITE
4.11.2.
RT-PCR
46
4.12.
COMPUTERANALYSEN
47
5.
ERGEBNISSE
48
5.1
INDUKTION
DER
P*-DEHYDROGENASE
48
5.2.
REAKTIONEN
AUF
GAMONE
IN
MUCOR
MUCEDO
50
5.2.1.
ZYGOPHORENINDUKTION
DURCH
4-DIHYDROMETHYL-TRISPORAT
51
5.2.2.
ABBAU
VON
4-DIHYDROMETHYL-TRISPORAT
DURCH
DIE
P*-DEHYDROGENASE
52
5.3.
REINIGUNG
DER
P
'
-DEHYDROGENASE
55
5.3.1.
ULTRAFILTRATION
55
5.3.2.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
55
5.3.3.
GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
57
5.3.4.
AFFINITATSCHROMATOGRAPHIE
60
5.3.5.
ZUSAMMENFASSUNG
DES
REINIGUNGSPROTOKOLLS
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
ENZYMS
61
5.4.
ISOLIERUNG
DER
CDNA
FUER
DIE
P
+
-DEHYDROGENASE
64
5.4.1.
ISOLIERUNG
EINER
SPEZIFISCHEN
SONDE
FUER
DAS
P*-DEHYDROGENASE-GEN
64
5.4.2
ISOLIERUNG
DER
CDNA
MITTELS
RT-PCR
68
5.5.
DIE
KREUZUNGSTYPSPEZIFISCHE
EXPRESSION
DES
P
'
-DEHYDROGENASE-GENS
73
6.
DISKUSSION
76
6.1.
INDUKTION
UND
REINIGUNG
DER
P
+
-DEHYDROGENASE
76
6.2.
DIE
P
-DEHYDROGENASE
INNERHALB
DER
ALDO-KETO-REDUKTASE
FAMILIE
77
6.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISOLIERTEN
DNA
FUER
DIE
P^-DEHYDROGENASE
79
6.4.
DIE
DIFFERENTIELLE
EXPRESSION
DES
P
+
-DEHYDROGENASE-GENS
80
6.5.
AUSBLICK
82
7.
ZUSAMMENFASSUNG
83
8.
LITERATURVERZEICHNIS
84
9.
ANHANG
91 |
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