Thermophile Lipasen aus Bacillus thermocatenulatus: Screening, Reinigung, Charakterisierung, Klonierung
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1994
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | VIII, 165 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALT
I.
EINLEITUNG
1
1.1
LIPASEN
-
SUBSTRATSPALTUNG
AN
GRENZFLAECHEN
.
1
1.2
MOLEKULARE
STRUKTUR
DER
LIPASEN
.
3
1.3
LIPASEN
IN
BIOTECHNOLOGIE
UND
MEDIZIN
.
9
1.4
PROBLEMSTELLUNG
.
10
II.
ERGEBNISSE
12
2.1
PHOTOMETRISCHER
LIPASEASSAY
MIT
OLIVENOEL
ALS
SUBSTRAT
.
12
2.2
SCREENING,
LIPASEPRODUKTION,
AUFARBEITUNG
UND
REINIGUNG
DER
NATI
VEN
LIPASE
BTL-1
.
14
2.2.1
SCREENING
THERMOPHILER
BACI7/US-STAEMME
AUF
LIPASEPRODUKTION
14
2.2.2
OPTIMIERUNG
DER
LIPASEPRODUKTION
.
15
2.2.3
LIPASEPRODUKTION
.
16
2.2.3.1
SCHUETTELKOLBENKULTIVIERUNG
.
16
2.2.3.2
FERMENTATION
IM
6
1
MASSSTAB
.
16
2.2.3.3
FERMENTATION
IM
100
1
MASSSTAB
.
18
2.2.4
KONZENTRIERUNG
VON
KULTURUEBERSTAENDEN
.
19
II
2.2.5
ENZYMREINIGUNG
.
21
2.2.5.1
AUFARBEITUNG
VON
FERMENTATIONSBRUEHE
.
21
2.2.5.2
HEXANEXTRAKTION
UND
METHANOLFAELLUNG
.
22
2.2.5.3
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
22
2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
NATIVEN
LIPASE
BTL-1
.
25
2.3.1
MOLEKULARGEWICHT
.
25
2.3.2
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
25
2.3.3
TRANSMISSIONS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
27
2.3.4
PH-AKTIVITAETSOPTIMUM
UND
PH-STABILITAET
.
31
2.3.5
TEMPERATURAKTIVITAETSOPTIMUM
UND
TEMPERATURSTABILITAET
.
33
2.3.6
LOESUNGSMITTELEINFLUSS
.
35
2.3.7
EINFLUSS
VON
DETERGENTIEN
.
35
2.3.8
EINFLUSS
VON
REAGENTIEN
.
37
2.3.9
SUBSTRAT
UND
POSITIONSSPEZIFITAET
.
38
2.3.10
UNTERSUCHUNG
DES
CACLJ-EINFLUSSES
AUF
DIE
LIPASEAKTIVITAET
.
41
2.3.11
IMMOBILISIERUNG
DES
ENZYMS
.
41
2.3.12
N-TERMINALE
SEQUENZUNTERSUCHUNG
.
41
2.3.13
AMINOSAEUREZUSAMMENSETZUNG
DER
LIPASE
.
42
2.4
KLONIERUNG
DER
LIPASE
BTL-2
.
44
2.4.1
KONSTRUKTION
EINER
DNA-SONDE
.
45
2.4.2
ERZEUGUNG
EINER
SUBGENOMISCHEN
GENBANK
MIT
VOLLSTAENDIG
VER
DAUTER
GENOMISCHER
DNA
.
46
III
2.4.3
ERZEUGUNG
EINER
SUBGENOMSICHEN
GENBANK
MIT
PARTIELL
VER
DAUTER
GENOMISCHER
DNA
.
47
2.4.4
UNTERSUCHUNG
DER
PLASMIDE
PLIPL
UND
PLIP2
.
47
2.4.4.1
ANSEQUENZIERUNG
DER
INSERTE
IN
PLIPL
UND
PLIP2
.
.
47
2.4.4.2
HYBRIDISIERUNG
VON
PLIPL
MIT
DER
DNA-SONDE
.
48
2.4.4.3
RESTRIKTIONSANALYSE
UND
DELETIONSKLONE
VON
PLIPL
.
48
2.4.5
NUKLEOTIDSEQUENZ
DES
LIPASE
BTL-2
.
51
2.5
PRODUKTION
UND
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
LIPASE
BTL-2
.
56
2.5.1
LIPASEPRODUKTION,
ZELLAUFSCHLUSS
UND
HITZEDENATURIERUNG
.
56
2.5.2
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
57
2.5.3
HYDROPHOBE
CHROMATOGRAPHIE
.
57
2.6
CHARAKTERISIERUNG
DER
LIPASE
BTL-2
.
59
2.6.1
MOLEKULARGEWICHT
.
59
2.6.2
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
.
61
2.6.3
PH-AKTIVITAETSOPTIMUM
UND
PH-STABILITAET
.
62
2.6.4
TEMPERATURAKTIVITAETSOPTIMUM
UND
TEMPERATURSTABILITAET
.
64
2.6.5
EINFLUSS
VON
CACH
AUF
DIE
LIPASEAKTIVITAET
.
65
2.6.6
LOESUNGSMITTELEINFLUSS
.
65
2.6.7
EINFLUSS
VON
REAGENTIEN
.
66
2.6.8
EINFLUSS
VON
DETERGENTIEN
.
67
2.6.9
INTERPHASENAKTIVIERUNG
.
69
2.6.10
SUBSTRATSPEZIFITAET
.
69
IV
III.
DISKUSSION
73
3.1
SCREENING,
LIPASEPRODUKTION,
REINIGUNG
DER
LIPASE
BTL-1
.
74
3.2
KLONIERUNG,
SEQUENZIERUNG,
REINIGUNG
DER
LIPASE
BTL-2
.
82
3.3
EIGENSCHAFTEN
DER
NATIVEN
LIPASE
BTL-1
UND
DER
REKOMBINANTEN
LI
PASE
BTL-2
95
3.4
AUSBLICK
.
103
IV.
ZUSAMMENFASSUNG
106
V.
MATERIAL
UND
METHODEN
108
5.1
MATERIAL
.
108
5.1.1
GERAETE
.
108
5.1.2
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
WEITERES
VERBRAUCHSMATERIAL
.
109
5.2
ALLGEMEINE
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.
112
5.2.1
LIPASEAKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
112
5.2.1.1
PHOTOMETRISCHER
ASSAY
MIT
PNPP
ALS
SUBSTRAT
.
112
5.2.1.2
PHOTOMETRISCHER
ASSAY
MIT
OLIVENOEL
ALS
SUBSTRAT
.
.
112
5.2.1.3
PH-STAT
ASSAY
.
114
5.2.1.4
SCHNELLTEST
ZUR
DETEKTION
VON
LIPASEAKTIVITAET
.
115
5.2.2
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
115
5.2.3
PROTEASEAKTIVITAETSBESTIMMUNG
.
116
5.2.4
ANALYTISCHE
GELELEKTROPHORESE
.
116
5.2.5
PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE
UND
PROTEINBLOTTING
.
117
V
5.2.6
N-TERMINALE
SEQUENZ
UND
AMINOSAEUREANALYSE
.
117
5.3
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
118
5.3.1
STAMM
UND
KLONIERUNGSVEKTOR
.
118
5.3.2
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
118
5.3.3
FAELLUNG
UND
PHENOL-CHLOROFORM
EXTRAKTION
VON
DNA
.
118
5.3.4
DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
119
5.3.5
DNA-ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
.
119
5.3.6
PLASMIDPRAEPARATION
.
119
5.3.7
ENZYMATISCHE
DNA-MODIFIKATIONEN
.
120
5.3.8
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
.
120
5.3.9
MEDIEN
UND
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
.
121
5.3.10
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
.
121
5.3.11
PCR-REAKTION
.
122
5.3.12
OLIGONUKLEOTID-SYNTHESE
.
122
5.3.13
DIG
3
'
-ENDMARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
122
5.3.14
SOUTHERN
BLOTTING
UND
HYBRIDISIERUNG
.
123
5.3.15
DETEKTION
VON
DIG
MARKIERTER
DNA
.
124
5.3.16
DNA-SEQUENZIERUNG
.
124
5.4
SCREENING,
AUFARBEITUNG
UND
REINIGUNG
DER
NATIVEN
LIPASE
BTL-1
.
.
125
5.4.1
THERMOPHILE
BACILLUS-STAEMME
.
125
5.4.2
SCREENING
.
125
5.4.3
OPTIMIERUNG
DER
LIPASEPRODUKTION
.
126
VI
5.4.4
LIPASEPRODUKTION
.
126
5.4.4.1
SCHUETTELKOLBENKULTIVIERUNGEN
.
126
OE.4.4.2
FERMENTATION
IM
6
1
MASSSTAB
.
127
5.4.4.3
FERMENTATION
IM
100
1
MASSSTAB
.
127
5.4.5
KONZENTRIERUNG
VON
KULTURUEBERSTAND
.
128
5.4.5.1
CROSS-FLOW-FILTRATION
.
128
5.4.5.2
GEFRIERTROCKNUNG
.
129
5.4.5.3
DUENNSCHICHTVERDAMPFUNG
.
129
5.4.6
ENZYMREINIGUNG
.
129
5.4.6.1
AUFARBEITUNG
VON
FERMENTATIONSBRUEHE
.
129
5.4.6.2
HEXANEXTRAKTION
UND
METHANOLFAELLUNG
.
130
5.4.6.3
ANIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
130
5.5
DURCHFUEHRUNG
DER
KLONIERUNGSARBEITEN
.
131
5.5.1
DNA-SONDENKONSTRUKTION
.
131
5.5.1.1
PRIMER-SYNTHESE
UND
PCR-REAKTION
.
131
5.5.1.2
SEQUENZIERUNG
DES
PCR-PRODUKTES
UND
SYNTHESE
DES
OLIGONUKLEOTIDES
SEQPCR
.
132
5.5.1.3
DIG
3
'
-ENDMARKIERUNG
DER
DNA-SONDEN
.
132
5.5.2
ERZEUGUNG
EINER
SUBGENOMISCHEN
GENBANK
MIT
VOLLSTAENDIG
VER
DAUTER
GENOMISCHER
DNA
.
133
5.5.2.1
VOLLSTAENDIGER
VERDAU
GENOMISCHER
DNA
.
133
5.5.2.2
SOUTHERN
BLOTTING
UND
HYBRIDISIERUNG
.
133
VII
5.5.2.3
ISOLIERUNG
UND
KLONIERUNG
VON
SACI
DNA-FRAGMENTEN
133
5.5.2.4
SCREENING
DER
SUBGENOMISCHEN
GENBANK
.
134
5.5.3
ERZEUGUNG
EINER
SUBGENOMISCHEN
GENBANK
MIT
PARTIELL
VER
DAUTER
GENOMISCHER
DNA
.
135
5.5.3.1
PARTIELLER
VERDAU
GENOMISCHER
DNA
.
135
5.5.3.2
KLONIERUNG
VON
SAU3A
DNA-FRAGMENTEN
.
135
5.5.3.3
EXPRESSIONS-SCREENING
DER
SUBGENOMISCHEN
GENBANK
136
5.5.4
UNTERSUCHUNG
DER
PLASMIDE
PLIPL
UND
PLIP2
.
136
5.5.4.1
ANSEQUENZIERUNG
DER
PLASMIDE
PLIPL
UND
PLIP2
.
.
136
5.5.4.2
HYBRIDISIERUNG
VON
PLIPL
MIT
DEM
OLIGONUKLEOTID
SEQPCR
.
137
5.5.4.3
RESTRIKTIONSENZYMANALYSE
DES
PLASMIDES
PLIPL
.
.
.
137
5.5.5
ERZEUGUNG
VON
DELETIONSKLONEN
.
137
5.5.6
SEQUENZIERUNG
DES
GENS
DER
LIPASE
BTL-2
.
139
5.6
REINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
LIPASE
BTL-2
.
140
5.6.1
KULTIVIERUNG
.
140
5.6.2
ZELLAUFSCHLUSS
UND
HITZEDENATURIERUNG
.
141
5.6.3
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
141
5.6.4
HYDROPHOBE
CHROMATOGRAPHIE
.
141
5.7
CHARAKTERISIERUNG
DER
LIPASEN
BTL-1
UND
BTL-2
.
142
5.7.1
TEMPERATUREINFLUSS
AUF
LIPASEAKTIVITAET
UND
-STABILITAET
.
142
5.7.2
PH-EINFLUSS
AUF
LIPASEAKTIVITAET
UND
-STABILITAET
.
143
VIII
5.7.3
LOESUNGSMITTELEINFLUSS
.
143
5.7.4
EINFLUSS
VON
DETERGENTIEN
.
.
144
5.7.5
EINFLUSS
VON
REAGENTIEN
.
144
5.7.6
POSITIONSSPEZIFITAET
DER
LIPASE
BTL-1
.
145
5.7.7
SUBSTRATSPEZIFITAET
DER
LIPASEN
BTL-1
UND
BTL-2
.
145
5.7.8
INTERPHASENAKTIVIERUNG
DER
LIPASE
BTL-2
.
146
5.7.9
CACLJ-EINFLUSS
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
LIPASEN
BTL-1
UND
BTL-2
146
5.7.10
IMMOBILISIERUNG
DER
LIPASE
BTL-1
.
147
5.7.11
TRANSMISSIONS-ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
148
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
149 |
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