Die Bedeutung von Saccharose-Stoffwechselgenen für die bakterielle Isomaltulose-Herstellung:
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| Sprache: | German |
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1995
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DIE BEDEUTUNG VON SACCHAROSE-STOFFWECHSELGENEN
FUER DIE BAKTERIELLE ISOMALTULOSE-HERSTELLUNG
VON DER FAKULTAET GEO- UND BIOWISSENSCHAFTEN DER UNIVERSITAET STUTTGART
ZUR ERLANGUNG DER WUERDE EINES DOKTORS
DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)
GENEHMIGTE ABHANDLUNG
VORGELEGT VON
KATHRIN KLEIN
AUS STUTTGART
HAUPTBERICHTER: PROF. DR. R. MATTES
MITBERICHTER: PROF. DR. C. SYLDATK
TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 19.7.1995
UNIVERSITAET STUTTGART
INSTITUT FUER INDUSTRIELLE GENETIK
1995
IMAGE 2
1. ZUSAMMENFASSUNG 11
2. EINLEITUNG 12
3. MATERIAL UND METHODEN 18
3.1. BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE 18
3.2. CHEMIKALIEN, ENZYME 22
3.3. PUFFER, LOESUNGEN, MEDIEN 24
3.3.1. MEDIEN 24
3.3.2. PUFFER UND LOESUNGEN 25
3.4. STAMMHALTUNG, ANZUCHTBEDINGUNGEN 27
3.5. PROTEINANALYTISCHE METHODEN 27
3.5.1. PRAEPARATION VON GANZZELLEN FUER AKTIVITAETSTESTS 27
3.5.2. PRAEPARATION VON IMMOBILISATEN IM MIKROMASSSTAB - 27
3.5.2.1. IMMOBILISIERUNG IN CALCIUMALGINAT 28
3.5.2.2. QUELLEN VON GETROCKNETEM IMMOBILISAT 28
3.5.3. ZELLAUFSCHLUSS MIT ULTRASCHALL 28
3.5.4. PROTEINQUANTIFIZIERUNG (BRADFORD, 1976) 29
3.5.5. POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 29
3.5.6. ENZYMTESTS 30
3.5.6.1. SACCHAROSE-MUTASE AKTIVITAET 30
3.5.6.2. GLUCOSE-OXIDASE-TEST (NACH WERNER ET AL., 1970) 31
3.5.7. ZUCKERANALYTIK 31
3.5.7.1. DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 31
3.5.7.2. *HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) 32
3.6. MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 34
3.6.1. DNA-PRAEPARATION 34
3.6.1.1. ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA 34
3.6.1.2. PLASMIDSCHNELLISOLIERUNG (MODIFIZIERT NACH KIESER, 1984) 35
3.6.1.3. M13-PHAGENVERMEHRUNG UND ISOLIERUNG VON ML3 EINZELSTRANG-DNA 35
IMAGE 3
V 6
3.6.2. ENZYMATISCHE BEHANDLUNG VON DNA (SAMBROOK ET AL., 1989) 36
3.6.2.1. SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 36
3.6.2.2. HERSTELLUNG VON X-DNA-MOLEKULARGEWICHTSMARKERN 36
3.6.2.3. BEHANDLUNG MIT KLENOW-ENZYM 36
3.6.2.4. BEHANDLUNG MIT ALKALISCHER PHOSPHATASE (AP) 36
3.6.2.5. BEHANDLUNG MIT T4-DNA-LIGASE 37
3.6.2.6. AMPLIFIKATION DESPA4-GENS MITTELS PCR
(POLYMERASE-KETTENREAKTION) 37
3.6.2.7. HERSTELLUNG VON DIGOXIGENIN (DIG)-MARKIERTEN SONDEN 37
3.6.3. TRANSFER VON DNA 38
3.6.3.1. KOMPETENTE.CO//-ZELLEN 38
3.6.3.2. PRAEPARATION VON ZELLEN FUER ELEKTROPORATION (NACH DOWER ET AL.,
1988) 38
3.6.3.3. TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA 38
3.6.3.4. KONJUGATIVER DNA-TRANSFER NACH P.RUBRUM 40
3.6.3.5. TRANSFEKTION MIT M13-DOPPELSTRANG-DNA 40
3 6.3.6. INFEKTION MIT XRESLI-PHAGEN 40
3.6.4. DNA-GELELEKTROPHORESE 41
3.6.4.1. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE - 41
3.6.4.2. ELUTION VON DNA AUS LMP-AGAROSE 41
3.6.4.3. UEBERTRAGUNG VON DNA AUF NYLONMEMBRANEN 42
3.6.4.4. HYBRIDISIERUNG MIT DIG-MARKIERTEN SONDEN 42
3.6.4.5. CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS 43
3.6.5. MUTAGENESE 43
3.6.5.1. MNNG-MUTAGENESE (NACH MILLER, 1972) MIT AMPICILLIN-SELEKTION 43
3.6.5.2. Y8-MUTAGENESE (NACH STRATHMANN ET AL., 1991) 44
3.6.6. SUICIDE-PLASMID-SYSTEM IN P.RUBRUM UND AUFBAU DER
DELETIONS-KASSETTEN 45
3.6.6.1. AUFBAU DER DELETIONS-KASSETTEN 45
3.6.6.2. UEBERPRUEFUNG DER GENOMISCHEN DELETIONEN AUF DNA-EBENE 46
3.6.7. COMPUTERPROGRAMME UND DOKUMENTATION 47
IMAGE 4
4. ERGEBNISSE 48
4.1. BILDUNG UND ABBAU VON PALATINOSE DURCH P.RUBRUM CBS 574.77 48
4.1.1. PALATINOSE-ABBAU 49
4.1.2. BILDUNG VON PALATINOSE WAEHREND DES WACHSTUMS VON P.RUBRUM-ZDLEN
50
4.1.3. MUTANTEN IM SACCHAROSE-KATABOLISMUS 53
4.1.4. ISOLIERUNG VON GENOMISCHEN FRAGMENTEN 54
4.1.4.1. AUESII-GENBANK 54
4.1.5. PALATINOSE-VERWERTUNG 55
4.1.5.1. DAS GENBANKPLASMID PKAT201 57
4.1.5.2. DAS GENBANKPLASMID PKAT203 58
4.1.5.3. EINGRENZUNG DER ZUM PAL-STOFLWECHSEL ESSENTIELLEN REGION AUF
PKAT203 58
4.1.5.4. DNA-SEQUENZ DER PAL-REGION AUF PKAT203 62
4.1.5.5. OFFENE LESERAHMEN AUF PKAT203 62
4.1.6. SACCHAROSE-VERWERTUNG 66
4.1.6.1. DAS GENBANKPLASMID PKATLOL 67
4.1.6.2. YS-TRANSPOSONMUTAGENESE DES PLASMIDS PKATLOL 67
4.1.6.3. ERMITTLUNG VON TEILSEQUENZEN AUF PKATLOL 69
4.1.6.4. ANALYSE ABGELEITETER PROTEINDATEN 69
4.1.6.5. DAS PLASMID PKAT102 71
4.1.6.6. EINGRENZUNG DER SACCHAROSE-ABBAU-REGION AUF PKAT102 71
4.1.6.7. SEQUENZERMITTLUNG UND HOMOLOGIEVERGLEICH 73
4.2. DELETION VON DNA-REGIONEN IN P.RUBRUM 75
4.2.1. KONSTRUKTION DER DELETIONS-KASSETTEN 75
4.2.1.1. DELETIONS-KASSETTE FUER GENE DES PALATINOSE-STOFFWECHSELS 76
4.2.1.2. DELETIONS-KASSETTE FUER SCP-GENE 78
4.2.1.3. DELETIONS-KASSETTE FUER DIE CSP-GENE 80
4.2.2. KONJUGATIVER TRANSFER UND NACHWEIS VON DELETIONEN IN P.RUBRUM 82
4.2.3. NACHWEIS DER DELETION BZW. INTEGRATION VON GENEN AUF DNA-EBENE 85
4.3. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG MULTIPLER DELETIONEN IN P.RUBRUM
87
4.3.1. INAKTIVIERUNG VON SCP UND CSP IM MUTASE-FREIEN DERIVAT VON
P.RUBRUM 87
4.3.2. MUTASE-BILDUNG UND REAKTION IN DELETIONSDERIVATEN VON P.RUBRUM 88
IMAGE 5
8
4.4. BIOTRANSFORMATION VON SACCHAROSE ZU PALATINOSE MIT
P.RUBRUM-MUTANTEN 90
4.5. AKTIVITAET DER CSP-INVERTASE UNTER PROZESSBEDINGUNGEN 92
5. DISKUSSION 95
5.1. KOMPONENTEN VON PALATINOSE- UND SACCHAROSE-ABBAUSYSTEMEN IN
P.RUBRUM 95 5.1.1. SACCHAROSE-AUFNAHME UND ABBAU UEBER DAS SCP-SYSTEM ,
95
5.1.2. CY-SYSTEM 99
5.1.3. PALATINOSE-BILDUNG UND ABBAU 101
5.2. MODELL FUER SACCHAROSE- UND PALATINOSE-STOFTWECHSEL IN P.RUBRUM 106
5.3. BEDEUTUNG DER VERSCHIEDENEN METABOLISCHEN WEGE FUER P.RUBRUM 108
5.4. SACCHAROSE-METABOLISMUS: EIN STOERFAKTOR FUER DIE ISOMERISIERUNG VON
SACCHAROSE? 109
6. ANHANG 111
7. LITERATURVERZEICHNIS 130
LEBENSLAUF 137
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| title_short | Die Bedeutung von Saccharose-Stoffwechselgenen für die bakterielle Isomaltulose-Herstellung |
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