Charakterisierung der Virus-Wirtszell-Interaktion des Maul-und-Klauenseuche-Virus:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
A.
EINLEITUNG
.
4
1.
DIE
MAUL
UND
KLAUENSEUCHE
.
4
2.
DAS
MAUL
UND
KLAUENSEUCHEVIRUS
.
5
3.
DIE
STRUKTUR
DES
MKSV
.
6
4.
GENOMORGANISATION
DES
MKSV
.
8
5.
DIE
PROTEINE
DES
MKSV
UND
IHRE
PROZESSIERUNG
.
10
6.
DIE
VERMEHRUNG
DES
MKSV
.
12
7.
EINFUEHRUNG
IN
DIE
VORLIEGENDE
ARBEIT
.
14
8.
ZIELSETZUNG
.
17
B.
ERGEBNISSE
.
19
1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
REZEPTORBINDUNGSSTELLE
DES
MKSV
.
19
1.1
EINFUEHRUNG
VON
PUNKTMUTATIONEN
IN
DAS
INFEKTIOESE
CDNA-PLASMID
.
20
1.2
DAS
VERHALTEN
DER
VIRUSMUTANTEN
IN
ZELLKULTUR
.
26
1.3
NACHWEIS
DER
VIRALEN
TRANSLATION
UND
RNA-REPLIKATION
NACH
TRANSFEKTION
VON
BHK-ZELLEN
.
28
1.4
NACHWEIS
VON
VIRUSPARTIKELN
DURCH
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
31
1.5
EXPRESSION
DES
STRUKTURPROTEINS
P1
.
34
1.5.1
DAS
SV40
EXPRESSIONSSYSTEM
.
34
1.5.1.1
KONSTRUKTION
DES
PLASMIDS
PSVL-P1
.
34
1.5.1.2
EXPRESSION
VON
P1
IN
ZELLKULTUR
.
36
1.5.1.3
HERSTELLUNG
EINER
T-ANTIGEN
PRODUZIERENDEN
BHK-ZELLINIE
.
36
1.5.2
DAS
SEMLIKI
FOREST
VIRUS
EXPRESSIONSSYSTEM
.
38
1.5.2.1
EXPRESSION
DES
STRUKTURPROTEINS
P1
IN
BHK-ZELLEN
.
40
1.6
KOMPLEMENTATION
DES
MUTIERTEN
STRUKTURPROTEINS
P1D
IN
VIVO
.
42
1.6.1
DER
EFFEKT
DER
P1
D-KOMPLEMENTATION
AUF
DIE
ADSORPTIONSFAEHIGKEIT
DER
VIRUSMUTANTEN
.
42
2.
IDENTIFIZIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
WIRTSZELLREZEPTORS
.
46
INHALTSVERZEICHNIS
2.1
TRANSFEKTION
VON
DNA
AUS
INFIZIERBAREN
IN
NICHT
INFIZIERBARE
ZELLEN
.
49
2.1.1
TRANSFEKTION
VON
CHO-ZELLEN
MIT
DEM
PLASMID
PLELACZ
.
50
2.1.2
TRANSFEKTION
VON
CHO-ZELLEN
MIT
CHROMOSOMALER
BK-DNA
.
53
2.1.3
NACHWEIS
VON
INSERIERTER
BOVINER
DNA
.
57
2.2
HERSTELLUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
DEN
WIRTSZELLREZEPTOR
.
61
2.2.1
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
MIT
VITALEN
ZELLEN
.
61
2.2.2
BINDUNGSVERHALTEN
DES
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
1
0A5-26
.
62
2.2.3
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
.
63
2.2.4
PRIMAERE
CHO-TRANSFEKTANTEN
.
65
2.3
HERSTELLUNG
VON
ANTI-IDIOTYPISCHEN
ANTIKOERPERN
.
67
2.3.1
TEST
DER
IMMUNSEREN
AUF
BINDUNG
AN
BHK-ZELLEN
.
67
C.
DISKUSSION
.
72
1.
DIE
KAPSIDSTRUKTUREN
DER
PICORNAVIREN
.
73
1.1
DIE
REZEPTORBINDUNGSSTELLE
DES
MKSV
.
76
1.2
DIE
AS-SEQUENZ
RGD(L)
.
77
1.3
ETABLIERUNG
EINER
P1
-EXPRIMIERENDEN
BHK-ZELLINIE
.
79
2.
CHARAKTERISIERUNG
DES
WIRTSZELLREZEPTORS
FUER
MKSV
.
81
2.1
IST
DER
WIRTSZELLREZEPTOR
FUER
MKSV
EIN
INTEGRIN
?
.
84
D.
METHODEN
.
87
1.
BAKTERIENKULTUR
.
87
1.1
KULTIVIERUNG
UND
KONSERVIERUNG
VON
BAKTERIEN
.
87
1.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
87
1.3
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
87
2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
88
2.1
PLASMID-SCHNELLPRAEPARATION
.
88
2.2
PLASMID-SCHNELLPRAEPARATION
(LE
GOUILL
&
DAERY,
1991)
.
88
2.3
PRAEPARATIVE
PLASMIDISOLIERUNG
.
89
2.4
AUFREINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
UEBER
QUIAGEN-SAEULEN
.
90
2.5
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
90
-II
INHALTSVERZEICHNIS
3.
ARBEITEN
MIT
DNA-FRAGMENTEN
.
91
3.1
RESTRIKTION
VON
DNA
.
91
3.2
ABSPALTUNG
DER
5'
TERMINALEN
PHOSPHATGRUPPE
VON
DNA
.
91
3.3
AUFFUELLEN
VON
ZURUECKGESETZTEN
3'
ENDEN
.
91
3.4
PHOSPHORYLIERUNG
DER
5'
ENDEN
EINES
DNA-FRAGMENTS
.
92
3.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
92
3.6
"ANNEALING"
VON
SYNTHETISCH
HERGESTELLTEN
OLIGONUKLEOTIDEN
.
.
93
3.7
DNA-LIGATION
.
93
4.
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
93
4.1
ABTRENNUNG
VON
RADIOAKTIVEN
NUKLEOTIDEN
DURCH
GELCHROMATOGRAPHIE
.
93
4.2
REINIGUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
94
5.
GELELEKTROPHORESE
.
94
5.1
AGAROSEGELE
.
94
5.2
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELE
.
95
5.3
DISKONTINUIERLICHE
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
.
96
5.4
AUTORADIOGRAPHIE
.
97
6.
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
97
7.
SEQUENZANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
.
99
7.1
DNA-SEQUENZIERUNG
.
99
7.2
RNA-SEQUENZIERUNG
.
100
8.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEURE
.
101
8.1
SOUTHERN
BLOT
.
101
8.2
NORTHERN
BLOT
.
102
8.3
KOLONIEHYBRIDISIERUNG
.
102
9.
POLYMERASE
KETTENREAKTION
.
103
9.1
AMPLIFIKATION
VON
PST-REPEATSEQUENZEN
.
103
9.2
NACHWEIS
VON
BOVINER
DNA
.
104
9.3
NACHWEIS
VON
MINUSSTRANG-RNA
.
104
10.
MUTAGENESE
VON
DNA
.
105
10.1
MUTAGENESE
MITTELS
PCR
.
105
10.2
OLIGOVERMITTELTE
MUTAGENESE
.
107
-III
INHALTSVERZEICHNIS
10.2.1
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRANG-DNA
(SSDNA)
.
107
10.2.2
VERMEHRUNG
DES
HELFERPHAGEN
M13K07
.
107
11.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
MIT
SP6-RNA-POLYMERASE
.
108
12.
ZELLKULTUR
.
109
12.1
KULTIVIERUNG
UND
KONSERVIERUNG
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
109
12.2
ANLEGEN
EINER
PRIMAEREN
ZELLKULTUR
.
109
12.3
KULTIVIERUNG,
SCREENING
UND
KLONIERUNG
VON
HYBRIDOM-KULTUREN
.
110
13.
IMMUNISIERUNG
VON
MAEUSEN
.
111
14.
VIRUSVERMEHRUNG
.
111
14.1
VIRUSTITRATION
.
111
14.2
PLAQUEREDUKTIONSTEST
.
112
14.3
EINFRIEREN
VON
VIREN
.
112
14.4
VIRUSISOLIERUNG
.
113
14.4.1
AUFREINIGUNG
UEBER
10-30%
SUCROSE-GRADIENTENZENTRIFUGATION
(METHODEL)
.
113
14.4.2
AUFREINIGUNG
UEBER
SUCROSE-STUFENGRADIENTENZENTRIFUGATION
(METHODELL)
.
113
15.
ISOLIERUNG
VON
RNA
.
114
15.1
ISOLIERUNG
VON
MKSV-RNA
.
114
15.2
ISOLIERUNG
VON
GESAMTZELL-RNA
AUS
VIRUSINFIZIERTEN/TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.
115
15.2.1
METHODE
I
NACH
CHOMCZYNSKI
&
SACCI
(1987)
.
115
15.2.2
METHODELL
.
116
16.
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
BK-ZELLEN
.
116
17.
TRANSFEKTION
VON
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
117
17.1
KALZIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION
.
117
17.2
TRANSFEKTION
MIT
LIPOSOMEN
.
118
17.3
ELEKTROPORATION
.
118
18.
IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISMETHODEN
.
119
18.1
INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ
.
119
18.1.1
OBERFLAECHENFLUORESZENZ
AN
VITALEN
ZELLEN
.
119
18.1.2
INTRAZELLULAERE
FLUORESZENZ
AN
FIXIERTEN
ZELLEN
.
120
18.
1.3
"FLUORESCENCE
ACTIVATED
CELL
SORTING"
(FACS)
.
120
-IV
INHALTSVERZEICHNIS
18.1.3.1
SCREENING
NACH
CHO-TRANSFORMANTEN
.
120
18.1.3.2
SCREENING
NACH
BHK-BINDENDEN
ANTIKOERPERN
.
121
18.2
RADIOIMMUNPRAEZIPITATION
.
121
18.2.1
[
36
S]-MARKIERUNG
DER
ZELLEN
.
121
18.2.2
PRAEPARATION
DER
ZELLMEMBRANEN
.
121
18.2.3
IMMUNPRAEZIPITATION
.
122
18.3
IMMUNPRAEZIPITATION
MIT
BIOTINYLIERTEN
ZELLMEMBRANEN
.
123
18.4
IMMUNOBLOT
(WESTERN
BLOT)
.
124
19.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
.
125
E.
MATERIAL
.
126
1.
BAKTERIENSTAEMME
UND
KULTURMEDIEN
.
126
2.
ZELLINIEN
UND
KULTURMEDIEN
.
126
3.
PLASMIDE
.
127
4.
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
127
5.
ENZYME
.
129
6.
NUKLEINSAEUREN
UND
LAENGENSTANDARDS
.
130
7.
"KITS"
.
130
8.
SEREN
UND
ANTIKOERPER
.
130
9.
RADIOCHEMIKALIEN
.
131
10.
FEINCHEMIKALIEN
.
131
11.
VERBRAUCHSMATERIAL
.
133
12.
GERAETE
.
133
13.
SOFTWARE
.
135
F.
LITERATUR
.
136
ABKUERZUNGEN
.
149
-V |
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| author | Leippert, Martina |
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