Die YTA-Familie: eine neue Genfamilie ATP-bindender Proteine in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | 142 S. Ill., graph. Darst. |
Internformat
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INHALTSVERZEICHNIS
I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
II
VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
UND
ERKLAERUNGEN
1.
EINLEITUNG
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
6
2.1
TABELLEN
DER
VERWENDETEN
STAEMME
6
2.2
MATERIALIEN
7
2.3
PUFFER
UND
LOESUNGEN
11
2.4
MEDIEN
15
2.5
METHODEN
16
2.5.1
IN
VIVO-EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEN
GENEN
IN
E.
CO/I-BAKTERIEN
16
2.5.1.1
IPTG-INDUZIERTE
EXPRESSION
16
2.5.1.2
ISOLIERUNG
VON
EINSCHLUSSKOERPEM
16
2.5.2
GELELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
17
2.5.2.1
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
17
2.5.2.2
NICHT-DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
17
2.5.23
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
18
2.5.2.4
ELEKTROELUTION
VON
PROTEINBANDEN
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
18
2.5.3
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPERPRAEPARATIONEN
19
2.5.3.1
GEWINNUNG
SPEZIFISCHER
DOTTERANTIKOERPER
19
2.5.3.1.1
IMMUNISIERUNG
VON
LEGEHENNEN
19
2.5.3.1.2
ISOLIERUNG
VON
IMMUNGLOBULINEN
IGG
AUS
EIDOTTER
19
2.53.2
GEWINNUNG
SPEZIFISCHER
ANTISEREN
AUS
KANINCHEN
20
2.5.33
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
21
2.5.4
SPEZIFISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
21
2.5.4.1
ELEKTROPHORETISCHER
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
("WESTERN
BLOTTING")
21
2.5.4.2
IMMUNDEKORATION
VON
PROTEINEN
UND
NACHWEIS
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
ODER
MEERRETTICH-PEROXIDASE
22
2.5.5
PRAEPARATION
EINER
HOCHMOLEKULAREN,
POSTMIKROSOMALEN
PROTEINFRAKTION
AUS
HEFE
23
2.5.5.1
GRADIENTENZENTRIFUGATION
23
2.5.5.2
AKTIVITAETSTEST
DES
20S
BZW.
26S
PROTEASEKOMPLEXES
24
2.5.5.2.1
FLUORIMETRISCHER
AKTIVITAETSTEST
24
2.5.5.2.2
AKTIVITAETSTEST
IM
GEL
24
2.5.53
TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE
25
2.5.6
ISOLIERUNG
VON
DNA
25
2.5.6.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID
BZW.
COSMID-DNA
AUS
E.
COLI
-BAKTERIEN
25
2.5.6.1.1
PRAEPARATION
IM
KLEINEN
MASSSTAB
25
2.5.6.1.2
PRAEPARATION
IM
GROESSEREN
MASSSTAB
25
2.5.6.2
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
HEFE
26
2.5.6.2.1
GENOMISCHE
DNA
AUS
HEFE
26
2.5.6.2.2
PRAEPARATION
VON
HEFECHROMOSOMEN
FUER
DIE
PULSFELD-
GELELEKTROPHORESE
26
2.5.7
GELELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNA
27
2.5.7.1
GELELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
IM
AGAROSEGEL
27
2.5.1.2
ELEKTROELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
27
2.5.12
PULSFELD-GELELEKTROPHORESE
27
2.5.7.4
SEQUENZ-GELELEKTROPHORESE
28
2.5.8
SPEZIFISCHER
NACHWEIS
VON
DNA
AUF
EINER
MEMBRAN
28
2.5.8.1
TRANSFER
VON
DNA
AUS
DEM
AGAROSEGEL
AUF
EINE
MEMBRAN
("SOUTHEM-BLOTTING")
28
2.5.8.2
HERSTELLUNG
VON
SLOT-BLOT-FILTEM
29
2.5.83
HERSTELLUNG
VON
KOLONIEFILTEM
29
2.5.8.4
HYBRIDISIERUNG
29
2.5.9
ENZYMATISCHE
REAKTIONEN
MIT
DNA
30
2.5.9.1
SEQUENZREAKTIONEN
MIT
PLASMID-DNA
30
2.5.9.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
30
2.5.93
PHOSPHATASEBEHANDLUNG
31
2.5.10
ISOLIERUNG
VON
RNA
31
2.5.10.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEFE
31
2.5.10.2
ISOLIERUNG
VON
MRNA
AUS
HEFE
32
2.5.11
GELELEKTROPHORESE
VON
RNA
UND
SPEZIFISCHER
NACHWEIS
AUF
EINER
MEMBRAN
32
2.5.11.1
FORMALDEHYD-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
32
2.5.11.2
TRANSFER
VON
RNA
AUF
EINE
MEMBRAN
("NORTHEM-BLOTTING")
UND
HYBRIDISIERUNG
32
2.5.12
ZELLTRANSFORMATION
33
2.5.12.1
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/I-BAKTERIEN
33
2.5.12.1.1
TRANSFORMATIONSKOMPETENTE
BAKTERIEN
33
2.5.12.1.2
TRANSFORMATION
MIT
PLASMIDEN
UND
COSMIDEN
33
2.5.12.1.3
TRANSFEKTION
VON
E.
CO/I-BAKTERIEN
MIT
PHAGEN
33
2.5.12.2
TRANSFORMATION
VON
HEFE
33
2.5.13
DAS
TWO-HYBRID
-SYSTEM
34
2.5.13.1
TEST
AUF
EXPRESSION
DES
HIS3-GENS
IN
HEFE
34
2.5.13.2
SS-GALAKTOSIDASE-FILTERTEST
35
2.5.14
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE
AN
HEFEZELLEN
35
2.5.14.1
PRAEPARATION
VON
HEFEPROTOPLASTEN
35
2.5.14.2
FIXIERUNG
VON
HEFEPROTOPLASTEN
36
2.5.14.3
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG
36
2.5.15
TETRADENANALYSE
BEI
HEFEZELLEN
37
2.5.15.1
SPORULATION
VON
HEFEZELLEN
37
2.5.15.2
TETRADENANALYSE
37
3.
ERGEBNISSE
38
3.1
DER
WEG
ZUM
HOMOLOG
DES
HUMANEN
TAT-BINDENDEN
PROTEINS
TBP-1
AUS
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
38
3.1.1
INDIZIEN
FUER
EIN
HEFEHOMOLOG
DES
HUMANEN
PROTEINS
TBP-1
38
3.1.2
IDENTIFIZIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
ITA/-GENS
40
3.1.3
CHARAKTERISIERUNG
DES
WA/-GENS
42
3.2
IDENTIFIZIERUNG
WEITERER
"DELD-POSITIVER
"
KLONE
IN
ZWEI
HEFE-COSMIDBANKEN
44
3.2.1
DIE
YTA-FAMILIE,
EINE
NEUE
GENFAMILIE
IN
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
46
3.2.2
ZUORDNUNG
VON
YTA-GENEN
ZU
HEFECHROMOSOMEN
48
3.3
GENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
YTA1
UND
YTA2
50
3.3.1
HERSTELLUNG
DER
DISRUPTIONSKONSTRUKTE
PYTAL
"URA3,
PYTAL::HIS3
UND
PYTA2::URA3
50
3.3.2
DISRUPTION
VON
YTA1
UND
YTA2
52
3.3.3
YTA1
UND
YTA2
SIND
ESSENTIELLE
HEFEGENE
54
3.3.4
KOMPLEMENTATION
DES
YTA1
UND
DES
1TA2-DEFEKTS
IN
DEN
DISRUPTANTEN
56
3.3.4.1
KOMPLEMENTATION
DURCH
DIE
WILDTYPGENE
56
3.3.4.2
KOMPLEMENTATION
DES
KTA7-DEFEKTS
MIT
HUMANER
TBP-L-CDNA
59
3.3.4.2.1
DASKOMPLEMENTATIONSKONSTRUKTPYES-TBP-1
59
3.3.4.2.2
YTALP
ALS
HEFEHOMOLOG
DES
HUMANEN
TAT-BINDENDEN
PROTEINS
TBP-1
61
3.3.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
HETEROALLELISCHEN
DIPLOIDEN
DISRUPTANTEN
RGSY10,
RGSY20
UND
RGSY30
62
3.3.6
UEBEREXPRESSION
VON
YTA1
65
3.4
DIE
TRANSKRIPTION
DER
GENE
1TAJ
UND
YTA2
67
3.4.1
AKTIVIERUNG
DER
TRANSKRIPTION
DURCH
HITZESTRESS
67
3.4.2
COMPUTERANALYSEN
ZUR
TRANSKRIPTION
DER
GENE
YTA1
UND
YTA2
69
3.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
GENPRODUKTE
YTALP,
YTA2P
UND
YTA3P
70
3.5.1
SPEZIFISCHE
ANTIKOERPER
GEGEN
YTALP
72
3.5.1.1
IPTG-INDUZIERTE
EXPRESSION
VON
YTAI
72
3.5.1.2
PRAEPARATION
VON
REKOMBINANTEM
YTAL-PROTEIN
IN
EINSCHLUSSKOERPEM
74
3.5.1.3
GEWINNUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
ANTI-YTALP-DOTTERANTIKOERPEM
74
3.5.2
GEWINNUNG
VON
ANTISEREN
GEGEN
YTA2P
UND
YTA3P
76
3.5.3
IDENTIFIZIERUNG
DER
PROTEINE
YTALP,
YTA2P
UND
YTA3P
IN
DER
HEFE
76
3.5.3.1
NACHWEIS
DER
PROTEINE
YTALP,
YTA2P
UND
YTA3P
IN
EINER
HOCHMOLEKULAREN,
POSTMIKROSOMALEN
"26S-PROTEINFFAKTION"
AUS
HEFE
77
3.5.3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
"26S-PROTEINFRAKTION"
AUS
HEFE
79
3.5.4
INTRAZELLULAERE
LOKALISIERUNG
DER
YTA-PROTEINE
DURCH
IMMUNFLUORESZENZ-MIKROSKOPIE
83
3.6
UNTERSUCHUNG
VON
PROTEIN-PROTEIN-WECHSELWIRKUNGEN
DER
YTA-PROTEINE
MIT
HILFE
EINES
TWO-HYBRID-SYSTEMS
86
3.6.1
KONSTRUKTE
ZUR
EXPRESSION
VON
FUSIONSPROTEINEN
FUER
DAS
TWO-HYBRID-SYSTEM
88
3.6.2
WECHSELWIRKUNGEN
ZWISCHEN
YTA-PROTEINEN
90
3.6.3
ANALYSE
DER
STRUKTUREN,
DIE
FUER
DIE
WECHSELWIRKUNGEN
DER
PROTEINE
YTALP,
YTA2P
UND
SUGLP
VERANTWORTLICH
SIND
93
3.6.4
WECHSELWIRKUNGEN
VON
YTA-PROTEINEN
MIT
DEM
TATA-BOX
BINDENDEN
PROTEIN
98
4.
DISKUSSION
101
4.1
STRUKTUR
DER
YTA-PROTEINE
101
4.2
DIE
YTA-PROTEINE
ALS
SUBFAMILIE
DER
AAA-PROTEINE
IN
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
102
4.2.1
DIE
YTA-PROTEINE
UND
IHRE
VERWANDTEN
INNERHALB
DER
AAA-FAMILIE
102
4.2.2
SUGLP
UND
PAS8P
SIND
MITGLIEDER
DER
YTA-FAMILIE
106
4.2.3
EINIGE
YTA-PROTEINE
ALS
KANDIDATEN
FUER
REGULATORISCHE
UNTEREINHEITEN
DES
26S
PROTEASEKOMPLEXES
IN
DER
HEFE
107
4.3
NACHWEIS
VON
YTALP,
YTA2P
UND
YTA3P
IN
EINER
"26S-PROTEINFFAKTION"
108
4.4
YTA1
UND
YTA2
SIND
ESSENTIELLE
HEFEGENE
110
4.5
YTA1
UND
KL42-GENDOSISEFFEKTE
111
4.6
DIE
TRANSKRIPTION
DER
GENE
YTA1
UND
YTA2
112
4.7
CHARAKTERISTISCHE
VERAENDERUNGEN
DER
VERTEILUNG
VON
YTALP,
YTA2P
UND
YTA3P
INNERHALB
DER
HEFEZELLE
WAEHREND
DER
ZYTOKINESE
112
4.8
YTALP,
DAS
FUNKTIONELLE
HOMOLOG
DES
TAT-BINDENDEN
PROTEINS
TBP-1
IN
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
113
4.9
UNTERSUCHUNG
VON
YTAP-YTAP-WECHSELWIRKUNGEN
MIT
DEM
TWO-HYBRID-SY
STEM
114
4.9.1
DIE
ROLLE
DER
LEUCINZIPPER-STRUKTUREN
VON
YTALP,
YTA2P
UND
SUGLP
116
4.9.2
BIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
DER
YTAP-YTAP-WECHSELWIRKUNGEN
117
4.10
YTA-PROTEINE
ALS
AKTIVATOREN
DER
TRANSKRIPTION?
120
5.
ZUSAMMENFASSUNG
122
6.
LITERATURVERZEICHNIS
126
7.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
PRIMER
139
8.
LEBENSLAUF
142 |
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