Eine neue Resistenzdeterminante in Piperacillin-resistenten Labormutanten von Streptococcus pneumoniae:
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
S.
PNEUMONIAE
UND
PATHOGENITAET
1
1.2.
BEKAEMPFUNG
VON
PATHOGENEN
S.
PNEUMONIAE
2
1.3.
SS-LACTAMANTIBIOTIKA
2
1.4.
RESISTENZENTWICKLUNG
IN
S.
PNEUMONIAE
4
1.5.
SS-LACTAMRESISTENZ
IN
S.
PNEUMONIAE
4
1.6.
URSACHEN
FUER
DIE
RESISTENZENTWICKLUNG
5
1.7.
ENTWICKLUNG
NEUER
ANTIBIOTIKA
6
1.8.
SELEKTION
VON
LABORMUTANTEN
6
1.9.
ANALYSE
VON
LABORMUTANTEN
8
1.10.
DIE
RESISTENZDETERMINANTE
CIAH
8
1.11.
ZIEL
DER
ARBEIT
9
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
10
2.1.
BAKTERIENSTAEMME
10
2.1.1.
STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE
'
LEBORSTAEMXNE
10
2.1.2.
STREPTOCOCCUS
SPP.
10
2.1.3.
ESCHERICHIA
COLI
STAEMME
10
2.2.
PLASMIDE
11
2.3.
NAEHRMEDIEN
11
2.4.
MHK
-
BESTIMMUNG
DER
MINIMALEN
HEMMKONZENTRATION
13
2.4.1.
BESTIMMUNG
DER
MINIMALEN
HEMMKONZENTRATION
IN
MIKROTITERPLATTEN
13
2.4.2.
BESTIMMUNG
DER
MINIMALEN
HEMMKONZENTRATION
AUF
BLUTAGARPLATTEN
13
2.5.
DNA
-
TRANSFORMATION
13
2.5.1.
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
IN
ESCHERICHIA
COLI
13
2.5.1.1.
PROTOKOLL
NACH
CHUNG
ET
AL.
13
2.5.1.2.
TRANSFORMATION
NACH
DEM
PROTOKOLL
VON
INVITROGEN
14
2.5.1.3.
ELEKTRO-TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
14
2.5.2.
TRANSFORMATION
VON
S.
PNEUMONIAE
15
2.5.2.I.
PRAEPARATION
DES
KOMPETENZFAKTORS
16
2.5.2.2.
DARSTELLEN
DER
PRAEKOMPETENTEN
ZELLEN
16
2.6.
DNA
-
PRAEPARATION
17
2.6.1.
PLASMID-DNA-ISOLIENMG
AUS
ESCHERICHIA
COLI
17
2.6.1.1.
KOCHLYSATMETHODE
(HOLMES
UND
QUIGLEY,
1981)
17
2.6.I.2.
SAEULENREINIGUNG
VON
PLASMIDEN
17
2.6.2.
DNA-ISOLIERUNG
AUS
S.
PNEUMONIAE
18
2.6.2.1.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
18
2.6.2.2.
ISOLIERUNG
DES
PLASMIDS
PSP2
AUS
S.
PNEUMONIAE
18
2.7.
GELE
19
2.7.1.
SDS-PAGE
FUER
PROTEINE
19
2.7.2.
AGAROSEGELE
FUER
DNA
20
2.8.
EXTRAKTION
VON
DNA
AUS
AGAROSE
MIT
GENE-CLEAN
20
2.9.
LIGATIONEN
20
2.10.
DNA
-
SEQUENZIERUNG
21
2.11
OLIGONUKLEOTIDE
21
2.11.1
OLIGOS
FUER
PBP2B,
PBP2X
UND
CIAH
2
1
2.11.2.
OLIGOS
FUER
CPOA
22
2.12.
SOUTHERN
BLOT
22
2.12.1.
DNA-TRANSFER
AUF
NYLONMEMBRAN
22
2.12.2.
DARSTELLEN
DER
DIGOXYGENIN-MARKIERTEN
DNA-PROBEN
UND
HYBRIDISIERUNG
23
2.13.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
23
2.14.
PBPS
-
DARSTELLUNG
DER
PENICILLINBINDENDEN
PROTEINE
24
2.15.
KLONIERUNG
VON
CPOA
24
2.16.
AFFINITAETS-CHROMATOGRAPHIE
ZUR
ISOLIERUNG
VON
CPOA
25
2.17.
ELEKTROELUTION
VON
CPOA
AUS
ACRYLAMID
25
2.18.
ANTIKOERPER
GEGEN
CPOA
25
2.19.
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
26
2.20.
CHEMIKALIEN
26
2.21.
COMPUTERPROGRAMME
27
2.22.
ABKUERZUNGEN
27
3.
ERGEBNISSE
29
3.1.
PIPERACILLIN-RESISTENTE
MUTANTEN
(P-MUTANTEN)
29
3.1.1.
MUTATIONEN
IN
PENICILLIN-BINDENDEN
PROTEINEN
29
3.1.2.
KREUZRESISTENZ
GEGEN
SS-LAKTAMANTIBIOTIKA
31
3.1.3.
KOMPETENZ
33
3.1.3.1.
INDUZIEIBARKEIT
VON
KOMPETENZ
34
3.1.3.2.
PRODUKTION
VON
KOMPETENZFAKTOR
35
3.2.
CHARAKTERISIERUNG
EINER
RESISTENZDETERMINANTE
36
3.2.1.
IDENTIFIZIERUNG
EINES
DNA-RESTRIKTIONSFRAGMENTS
36
3.2.2.
KLONIERUNG
EINER
4
KB
RESISTENZDETERMINANTE
(542B)
39
3.2.3.
DNA-SEQUENZ
VON
542B
41
3.2.4.
HOMOLOGIEVERGLEICH
DER
LESERAHMEN
45
3.2.4.1.
PRIMASE
45
3.2.4.2.
SIGA
46
3.2.4.2.
1.
BETEILIGUNG
AN
RESISTENZENTWICKLUNG
46
3.2.4.2.2.
SEQUENZANALYSE
47
3.2.4.2.3.
VERWANDSCHAFTSANALYSE
49
3.2.4.2.4.
SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG
50
3.2.4.3.
ORF
2
UND
ORT
3
52
3.3.
ORF
3
-
CPOA
53
3.3.1.
MUTATIONEN
IN
CPOA
54
3.3.1.1.
CPOA
IN
P104
56
3.3.1.2.
CPOA
IN
P106
58
3.3.2.
PHAENOTYP
VON
CPOA
MUTANTEN
58
3.3.2.I.
RESISTENZ
GEGEN
SS-LAKTAMANTIBIOTIKA
59
3.3.2.2.
SYNTHESE
VON
PBPLA
60
3.3.2.3.
KOMPETENZ
61
3.3.2.4.
MORPHOLOGIE
62
3.3.3.
DELETIONSDERIVATE
63
3.3.4.
CPOA
IN
KLINISCHEN
STAEMMEN
UND
ANDEREN
STREPTOKOKKENSPEZIES
64
3.4.
ISOLIERUNG
VON
CPOA
66
3.4.1.
WAHL
DES
EXPRESSIONSSYSTEMS
66
3.4.2.
KLONIERUNG
67
3.4.3.
PRODUKTION
VON
CPOA
ALS
FUSIONSPROTEIN
68
3.4.4.
REINIGUNG
VON
MBP-CPOA
DUCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
71
3.4.5.
REINIGUNG
VON
CPOA
DURCH
ELEKTROELUTION
72
3.5.ANTIKOERPER
GEGEN
CPOA
73
3.5.1.
EMPFINDLICHKEIT
DES
ANTIKOERPERS
73
3.5.2.
EXPRESSION
VON
CPOA
IN
R6
74
3.5.3.
LOKALISIERUNG
VON
CPOA
75
4.
DISKUSSION
77
4.1.
PENICILLIN-BINDENDE
PROTEINE
77
4.2.
DIE
RESISTENZDETERMINANTE
CIAH
77
4.3.
CIAH
UND
KOMPETENZ
78
4.4.
PIPERACILLIN-RESISTENTE
LABORMUTANTEN
78
4.5.
DIE
RESISTENZDETERMINANTE
CPOA
79
4.6.
CPOA
UND
RESISTENZ
80
4.7.
CPOA
UND
KOMPETENZ
81
4.8.
CPOA
UND
PBPLA
82
4.9.
CPOA
VERSUS
CIAH
82
4.10.
FUNKTION
VON
CPOA
83
5.
ZUSAMMENFASSUNG
85
6.
LITERATUR
86 |
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