Isolierung und Charakterisierung von prototrophen Mutanten der Enterobakterien Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae mit Defekten in der Regulation der Ammoniumassimilation:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
I.
EINLEITUNG
1
1.
TRANSPORT
STICKSTOFFHALTIGER
SUBSTRATE
1
2.
ENZYME
DER
PRIMAEREN
AMMONIUM-ASSIMILATION
2
3.
REGULATION
DER
STICKSTOFF-ASSIMILATION
IN
ENTEROBAKTERIEN
4
DURCH
DAS
NTR-SYSTEM
4
3.1.
REGULATION
DURCH
DAS
NTR-SYSTEM
4
3.2.
REGULATION
DER
TRANSKRIPTION
DES
GLNANTRBC-OPERONS
6
4.
WEITERE
REGULATIONSSYSTEME
DES
STICKSTOFF-KATABOLISMUS
7
5.
PROBLEMSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
9
II.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
11
1.
BAKTERIENSTAEMME
11
2.
PHAGEN
12
3.
PLASMIDE
13
4.
MEDIEN,
CHEMIKALIEN
UND
GERAETE
IS
5.
ABSORPTIONSMESSUNGEN
19
6.
NACHWEIS
BAKTERIELLER
AMMONIAK-AUSSCHEIDUNG
UND
19
AMMONIUM-AUFNAHME
6.1.
AMMONIUMNACHWEIS
19
6.2.
BESTIMMUNG
DER
BAKTERIELLEN
EXKRETION
VON
AMMONIAK
IN
FLUESSIG
20
UND
AUF
FESTMEDIEN
6.3.
BESTIMMUNG
DER
AMMONIUM-AUFHAHMERATE
20
7.
TRANSPORT
VON
(
14
C)-METHYLAMMONIUMCHIORID
UND
20
(
14
C)
BZW.
(
3
H)-MARKIERTEN
AMINOSAEUREN
7.1.
HERSTELLUNG
DER
TESTSUSPENSION
20
7.2.
TRANSPORT
VON
(
14
C)
UND
(^HJ-MARKIERTEN
SUBSTRATEN
20
8.
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
21
8.1.
ZELLAUFSCHLUSS
21
8.2.
PROTEINBESTIMMUNG
21
8.3.
GLUTAMIN-SYNTHETASE
(EC
6.3.1.2.)
22
8.4.
GLUTAMAT-SYNTHASE
(EC
1.4.1.13.)
23
8.5.
GLUTAMAT-DEHYDROGENASE
(EC
1.4.1.4.)
24
8.6.
ASPARTAT-AMINOTRANSFERASE
(EC
2.6.1.1.)
24
8.7.
GLUTAMINASE
(EC
3.5.1.2.)
25
8.8.
ASPARAGINASE
(EC
3.5.1.1.)
26
8.9.
NITROGENASE
(EC
1.18.2.1.)
26
9.
GELELEKTROPHORETISCHE
VERFAHREN
27
9.1.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
27
9.2.
SEQUENZIERGELE
28
9.3.
SDS-GELE
28
10.
DNA-ISOLIERUNG
30
10.1.
ISOLIERUNG
PLASMIDALER
DNA
30
10.2.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
30
11.
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNGEN
VON
DNA
31
11.1.
HYDROLYSE
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
31
11.2.
ENTFERNUNG
ENDSTAENDIGER
PHOSPHATGRUPPEN
31
11.3.
BESEITIGUNG
DER
UEBERSTEHENDEN
DNA-EINZELSTRANGENDEN
32
11.3.1.
AUFFUELLREAKTION
FUER
EINZELSTRAENGIGE
5'-ENDEN
32
11.3.2.
ENZYMATISCHER
ABBAU
DER
EINZELSTRAENGIGEN
3'-ENDEN
32
11.4.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
33
12.
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
33
12.1.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
8
KB
33
12.2.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
VON
4-8
KB
33
12.3.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
4
KB
34
13.
TRANSFER
VON
DNA
34
13.1.
TRANSFORMATION
34
13.2.
KONJUGATION
34
14.
HERSTELLUNG
UND
EINSATZ
VON
PHAGENLYSATEN
35
14.1.
HERSTELLUNG
DES
PHAGENLYSATS
35
14.2.
INFEKTION
DES
REZIPIENTEN
35
14.3.
BESTIMMUNG
DES
PHAGENTITERS
35
15.
MUTAGENESEN
CHROMOSOMALER
DNA
36
15.1.
CHEMISCHE
MUTAGENESE
MIT
NITROSOGUANIDIN
(NG)
36
15.2.
TRANSPOSON-MUTAGENESE
36
15.2.1.
TRANSPOSONS
36
15.2.2.
X::TN5-MUTAGENESE
BEI
E.
COLI
UND
K.
PNEUMONIAE
37
15.3.
TN5-MUTAGENESE
BEI
K.
PNEUMONIAE
DURCH
PL-DOPPELINFEKTION
37
16.
HERSTELLUNG
EINER
GENBANK
VON
K.PNEUMONIAE
M5AL
38
MIT
EINEM
MINI-MU-REPLIKON
17.
DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG
40
17.1.
BLOTTING-VERFAHREN
DURCH
SOUTHERN
TRANSFER
40
17.2.
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-11-DUTP-MARKIERTER
DNA-SONDE
UND
41
NACHWEIS
DURCH
ENZYM-IMMUNOASSAY
17.2.1.
DNA-MARKIERUNG
42
17.2.2.
BILDUNG
DER
HYBRIDE
42
17.2.3.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
43
SEITE
18.
DNA-SEQUENZIERUNG
44
19.
WESTERN-BLOT
UND
NACHWEIS
EINES
ANTIGENS
MITTELS
ANTIKOERPERN
44
19.1.
UEBERTRAGUNG
VON
PROTEINEN
AUF
MEMBRANEN
45
19.2.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
45
ID.
ERGEBNISSE
47
1.
ISOLIERUNG
VON
MUTANTEN
DER
ENTEROBAKTERIEN
ESCHERIDUEA
COLI
UND
KLEBSIELLA
PNEUMONIAE
MIT
DEM
PHAENOTYP
LAA*
AMX
+
47
1.1.
TRANSPOSON
UND
CHEMISCHE
MUTAGENESE
BEI
47
E.
COLI
K12
UND
K.
PNEUMONIAE
M5AL
1.2.
SELEKTION
DER
MUTANTEN
MIT
DEM
PHAENOTYP
LAA"
AMX
+
48
1.2.1.
MUTANTEN
VON
E.
COLI
49
1.2.2.
MUTANTEN
VON
K.
PNEUMONIAE
49
1.3.
NACHWEIS
BAKTERIELLER
EXKRETION
VON
AMMONIAK
AUF
FESTMEDIEN
51
2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
VON
E.
COLI
52
2.1.
NACHWEIS
EINER
BAKTERIELLEN
AMMONIAKEXKRETION
52
2.2.
TRANSPORT
VON
(
14
C)-METHYLAMMONIUMCHLORID
53
2.3.
WACHSTUM
UND
VERWERTUNG
ANORGANISCHER
UND
ORGANISCHER
STICKSTOFFQUELLEN
54
2.3.1.
WACHSTUM
MIT
NH
4
C1
54
2.3.2.
WACHSTUM
MIT
ORGANISCHEN
STICKSTOFFQUELLEN
54
2.4.
EXPRESSION
UND
REGULATION
VON
ENZYMEN
DER
PRIMAEREN
NH
4
+-ASSIMILATION
55
2.4.1.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
UND
DER
REGULATION
55
DER
GLUTAMIN-SYNTHETASE
(GS)
2.4.2.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
GLUTAMAT-SYNTHASE
(GOGAT)
56
2.4.3.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
GLUTAMAT-DEHYDROGENASE
(GLU-DH)
56
2.5.
KOMPLEMENTATIONSANALYSE
MIT
DEM
PLASMID
PRSP21
58
3.
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
VON
K.
PNEUMONIAE
58
3.1.
NACHWEIS
BAKTERIELLER
EXKRETION
VON
AMMONIAK
58
3.2.
NH
4
+
-AUFNAHME
UND
TRANSPORT
VON
(
14
C)-METHYLAMMONIUMCLORID
60
3.2.1.
AUFNAHME
VON
NH
4
C1
61
3.2.2.
TRANSPORT
VON
(
14
C)-METHYIAMMONIUMCLORID
62
3.3.
WACHSTUM
MIT
ANORGANISCHEN
UND
ORGANISCHEN
N-QUELLEN
63
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
VON
AMINOSAEURE-TRANSPORTSYSTEMEN
66
3.5.
EXKRETION
VON
AMMONIAK
NACH
ANZUCHT
MIT
EINZELNEN
AMINOSAEUREN
67
ALS
N-QUELLEN
3.6.
NJ-FIXIERUNG
69
SEITE
3.7.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
UND
DER
REGULATION
DER
GLUTAMIN-SYNTHETASE
(GS)
71
3.8.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
GLUTAMAT-SYNTHASE
(GOGAT)
73
3.9.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
GLUTAMAT-DEHYDROGENASE
(GLU-DH)
73
3.10.
WEITERE
ENZYME
DES
STICKSTOFF-STOFFWECHSELS
75
4.
KOMPLEMENTATION
DES
LAA'
AMX
+
-PHAENOTYPS
DER
MUTANTE KP9
76
4.1.
ZUM
PHAENOTYP
DES
WILDTYPS
DURCH
GENERALISIERTE
TRANSDUKTION
GENERALISIERTE
TRANSDUKTION
MIT
HILFE
DES
PHAGENS
PIETS
76
4.2.
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TRANSDUKTANTEN
76
S.
KLONIERUNG
EINER
KOMPLEMENTIERENDEN
GENREGION
AUS
DER
GENBANK
78
5.1.
VON
K.
PNEUMONIAE
M5AL
HERSTELLUNG
EINER
GENBANK
VON
K.
PNEUMONIAE
M5AL
78
5.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-SEQUENZEN,
DIE
DEN
PHAENOTYP
LAA'
AMX
+
78
5.3.
ZUM
PHAENOTYP
DES
WILDTYPS
KOMPLEMENTIEREN
CHARAKTERISIERUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
ISOLIERTEN
DNA-REGION
80
6.
KOMPLEMENTATIONSANALYSE
DER
MUTANTE
KP9
83
7.
KOMPLEMENTATION
DER
G/NA'-MUTANTE
KP
UBM22
86
8.
DURCH
GENERALISIERTE
PL-TRANSDUKTION
EINFLUESSE
VON
SUBKLONEN
DER
SUPPRIMIERENDEN
GENREGIONEN
87
9.
AUF
DAS
PHYSIOLOGISCHE
VERHALTEN
DER
MUTANTE
KP9
NACHWEISE
EINER
VERMUTETEN
PROTEIN-UEBEREXPRESSION
92
9.1.
NACHWEIS
EINER
UEBEREXPRESSION
EINES
PROTEINS
DURCH
SDS-PAGE
92
9.2.
SPEZIFISCHER
NACHWEIS
DES
NTRC-PROTEINS
93
9.2.1.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
NTRC-PROTEINS
93
9.2.2.
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
VON
K.
PNEUMONIAE
94
10.
NACH
EXPRESSION
DES
NTRC-REGULATORPROTEINS
DURCH
DAS
PLASMID
PSA2
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
SUPPRESSORMUTANTE
XP9L::TN5
96
10.1.
ISOLIERUNG
EINER
SUPPRESSORMUTANTE
VON
KP9
NACH
TN5-MUTAGENESE
96
10.2.
NACHWEIS
EINER
CHROMOSOMALEN
TN5-INSERTION
DURCH
DNA-HYBRIDISIERUNG
96
10.3.
PHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
SUPPRESSORMUTANTE
AP91::TN5
97
10.4.
ISOLIERUNG
UND
KLONIERUNG
DER
MUTIERTEN
GENREGION
100
10.5.
ERSTELLUNG
EINER
GROBEN
RESTRIKTIONSKARTE
DES
PLASMIDS
PTTK3
100
10.6.
NACHWEIS
UND
IDENTIFIZIERUNG
DER
TRANSPOSON
UND
CHROMOSOMALEN
101
10.7.
DNA-REGION
AUF
DEM
PLASMID
PTTK3
DURCH
DNA-SEQUENZIERUNG
UMKLONIERUNG
DES
CHROMOSOMALEN
DNA-FRAGMENTS
AUS
PTTK3
FUER
DEN
EINSATZ
GEZIELTER
MUTAGENESE
103
SEITE
IV.
DISKUSSION
106
I.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
MUTANTEN
VON
E.
COLI
MIT
DEM
PHAENOTYP
LAA'
106
2.
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
MUTANTEN
VON
K.
PNEUMONIAE
MIT
DEM
PHAENOTYP
LAA'
AMX
+
109
3.
GENETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTE
KP9
112
4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
SUPPRESSORMUTANTE
KP91::TN5
118
V.
ZUSAMMENFASSUNG
120
VI.
SUMMARY
123
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
126
VIII.
ANHANG
140 |
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| author | Kuczius, Thorsten |
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