Tumortherapie mit bispezifischen Antikörpern: Entwicklung neuer Antikörperkonjugate und Etablierung eines In-vivo-Systems in CD2-transgenen Mäusen
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1995
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TUMORTHERAPIE MIT BISPEZIFISCHEN
ANTIKOERPERN:
ENTWICKLUNG NEUER ANTIKOERPERKONJUGATE UND ETABLIERUNG EINES IN VIVO
-SYSTEMS IN CD2- TRANSGENEN MAEUSEN
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES EINES DOKTORS DER
NATURWISSENSCHAFTEN AN DER FAKULTAET FUER BIO- UND GEOWISSENSCHAFTEN DER
UNIVERSITAET KARLSRUHE GENEHMIGTE DISSERTATION
VON
MARTIN WILD
AUS
FREIBURG IM BREISGAU
TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: REFERENT: KORREFERENTEN:
1995
14.06.1995 PROF. DR. S. MATZKU PROF. DR. P. HERRLICH PROF. DR. W. HANKE
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
1. DIE KOERPEREIGENE IMMUNABWEHR VON TUMOREN 1
2. MECHANISMEN, MIT DENEN TUMOREN DER IMMUNITAET AUSWEICHEN 8
3. METHODEN DER IMMUNTHERAPIE 9
4. BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER 10
5. WEGE DER T-ZELL-AKTIVIERUNG 16
6. SIGNALTRANSDUKTION IN T-LYMPHOZYTEN 20
7. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 23
II. MATERIAL UND METHODEN 25
1. ZELLKULTUR 25
1.1. ALLGEMEINE METHODEN DER ZELLKULTUR 25
1.1.1. KULTIVIERUNG VON ZELLEN 25
1.1.2. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL UND ZELLVITALITAET 25
1.1.3. KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 26
1.1.4. GENERIERUNG VON PHA-BLASTEN 26
1.2. KULTIVIERUNG VON ZELLINIEN 27
1.3. KULTIVIERUNG DES T-ZELL-KLONS C3F2 27
2. ZELLPRAEPARATIONS-METHODEN 28
2.1. PRAEPARATION HUMANER MONONUKLEAERER ZELLEN (PBMC) AUS DEM BLUT 28
2.2. ISOLIERUNG RUHENDER HUMANER T-LYMPHOZYTEN 28
2.3. PRAEPARATION MURINER MILZZELLEN 29
2.4. ISOLIERUNG MURINER T-LYMPHOZYTEN AUS DER MILZ 29
3. TIERE 30
4. MONOSPEZIFISCHE ANTIKOERPER 31
4.1. HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 31
4.1.1. IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN 31
4.1.2. ZELLFUSION 31
4.1.3. VERMEHRUNG UND KLONIERUNG VON HYBRIDOMZELLEN 33
4.2. REINIGUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER AUS HYBRIDOM-UEBERSTAENDEN 34 4.3.
SEPHAROSE-KOPPLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN 35
4.4. BIOTINYLIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN 36
4.5. EINGESETZTE ANTIKOERPER UND ANTISEREN 37
IMAGE 3
II INHALTSVERZEICHNIS
5. BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER 38
6. BESTIMMUNG DER BINDUNGSEIGENSCHAFTEN VON ANTIKOERPERN UND ANDEREN
PROTEINEN 39
6.1 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 39
6.1.1 EINFACH-FLUORESZENZ-IMMUNFAERBUNG 39
6.1.2. DOPPEL-FLUORESZENZ-IMMUNFAERBUNG 40
6.2. CD2-SPEZIFISCHER *ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 40 7.
BESTIMMUNG VON ZELLFUNKTIONEN 42
7.1. PROLIFERATIONSTEST 42
7.2. ZYTOTOXIZITAETSTEST / 42
7.3. SCHAF-ERYTHROZYTEN-ROSETTIERUNG (E-ROSETTIERUNG) 43
8. BIOCHEMISCHE METHODEN 44
8.1. IMMUNPRAEZIPITATION 44
8.2. IN V/FRO-PHOSPHATASE-TEST 45
8.3. IN V/FRO-KINASE-TEST 46
8.4. REPRAEZIPITATION 47
8.5. GELELEKTROPHORESE-METHODEN 47
8.5.1. EINDIMENSIONALE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 47
8.5.2. ZWEIDIMENSIONALE GELELEKROPHORESE 49
8.6. AUTORADIOGRAPHIE 51
8.7. WESTERN-BLOT 51
9. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 53
9.1: EXPRESSION VON REKOMBINANTEM CD2 IM BACULOVIRUS-SYSTEM 53
9.1.1. HERSTELLUNG EINES PAC-CD2-PLASMIDS 53
9.1.2. KULTIVIERUNG VON SF9-ZELLEN 54
9.1.3. KOTRANSFEKTION VON SF9-ZELLEN 55
9.1.4. *PLAQUE - ASSAY 55
9.1.5. VIRUS-VERMEHRUNG 57
9.1.6. LYSE VON SF9-ZELLEN 58
9.2. BESTIMMUNG DER KONZENTRATION UND REINHEIT VON NUKLEINSAEUREN 58
9.3. GELELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN 59
9.4. ISOLATION EUKARYONTISCHER DNA 59
9.4.1. ZELLPRAEPARATION UND-LYSE 59
9.4.2. NUKLEINSAEURE-EXTRAKTION 60
9.4.3. DNA-REINIGUNG 60
9.5. SOUTHERN-BLOT 60
9.5.1. HERSTELLUNG EINER RADIOAKTIVEN CD2-SONDE 61
9.5.2. RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA-MOLEKUELEN 62
9.5.3. AUFTRENNUNG VON DNA-RESTRIKTIONSFRAGMENTEN IN EINEM AGAROSE-GEL
62
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS III
9.5.4. DNA-TRANSFER VON EINEM AGAROSE-GEL AUF EINEN NYLON-FILTER 63
9.5.5. HYBRIDISIERUNG VON NYLON-FILTERN 64
9.5.6. AUTORADIOGRAPHIE 64
III. ERGEBNISSE 65
1. EXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG EINES REKOMBINANTEN CD2-PROTEINS 65
1.1. EXPRESSION DES REKOMBINANTEN CD2-PROTEINS DURCH BACULOVIRUS-
INFIZIERTE SF9-ZELLEN 65
1.2. CHARAKTERISIERUNG DES REKOMBINANTEN CD2-PROTEINS 66
1.2.1. EXPRESSION VON FUNKTIONEILEN EPITOPEN AUF DEM REKOMBINANTEN
CD2-MOLEKUEL 66
1.2.2. BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTES DES REKOMBINANTEN CD2-PROTEINS
IM WESTERN-BLOT 68
2. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NEUEN CD2-ANTIKOERPERN 70 2.1.
PRODUKTION VON NEUEN CD2-ANTIKOERPERN 70
2.2. BESTIMMUNG DER SPEZIFITAETEN DER NEUEN ANTIKOERPER 70
2.3. CHARAKTERISIERUNG DER NEUEN CD2-ANTIKOERPER 72
2.3.1. BLOCKIERUNG DER SCHAF-ERYTHROZYTEN-ROSETTIERUNG 72
2.3.2. KREUZBLOCKIERUNG ZWISCHEN CD2-ANTIKOERPERN 73
2.3.3. BINDUNG VON CD2-ANTIKOERPERN AN RUHENDE T-ZELLEN 74
2.3.4. INDUKTION DER PROLIFERATION HUMANER T-LYMPHOZYTEN 76
2.3.5. KOSTIMULATION DURCH CD58 BEI DER T-ZELL-AKTIVIERUNG DURCH
AICD2.M1 + AICD2.M2 77
2.3.6. INHIBITION DER CD3-STIMULATION VON T-LYMPHOZYTEN 78
3. IN VITRO -AUSTESTUNG VON CD2 X EGF-R-BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN 80
3.1. ANTIGEN-ERKENNUNG DURCH DIE BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER EMD 66344 UND
EMD 66229 81
3.2. BS AK-VERMITTELTE LYSE VON EGF-R-POSITIVEN ZELLEN DURCH EINEN
T-ZELL-KLON 82
3.3. SPEZIFITAET DER DURCH BISPEZIFISCHE ANTIKOERPER VERMITTELTEN
ZELL-LYSE 84 3.4. AKTIVIERUNG RUHENDER EFFEKTORZELLEN DURCH DIE
BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER EMD 66344 UND EMD 66229 86
3.5. MODULATION DES CD2-MOLEKUELS DURCH BS AK-VERMITTELTE KREUZVERNETZUNG
87 3.6. BSAK-VERMITTELTE LYSE VON EGF-R-POSITIVEN ZELLEN DURCH PBMC 89
IMAGE 5
IV INHALTSVERZEICHNIS
4. IN VITRO -AUSTESTUNG CD2-TRANSGENER MAUS-T-ZELLEN 93
4.1. BESTIMMUNG DER KOPIENZAHL DES HUMANEN CD2-GENS IN ZELLEN
CD2-TRANSGENER MAEUSE 93
4.2. EXPRESSION DES HUMANEN CD2 IN MILZZELL-PRAEPARATIONEN CD2-TRANSGENER
MAEUSE 95
4.3. EXPRESSION FUNKTIONELLER EPITOPE DES TRANSGENEN CD2-MOLEKUELS 97
4.4. BINDUNG VON REKOMBINANTEM CD58 AN DAS TRANSGENE CD2-MOLEKUEL 98 4.5.
STIMULATION TRANSGENER MURINER T-LYMPHOZYTEN UEBER DAS HUMANE CD2-MOLEKUEL
99
4.6. PROTEIN-ASSOZIATIONEN DES HUMANEN CD2-MOLEKUELS IN CD2-TRANSGENEN /
MURINEN T-LYMPHOZYTEN 102
4.6.1. ASSOZIATION DES TRANSGENEN HUMANEN CD2-MOLEKUELS MIT PHOSPHATASEN
102 4.6.2. ASSOZIATIONEN DES TRANSGENEN HUMANEN CD2 MIT PHOSPHOPROTEINEN
103 4.6.3. ASSOZIATIONEN DES TRANSGENEN HUMANEN CD2 MIT
SIGNALTRANSDUKTIONS- PROTEINEN 105
IV. DISKUSSION 107
1. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NEUARTIGEN MITOGENEN
CD2-ANTIKOERPERN 107
2. FUNKTION VON AICD2.M1 UND AICD2.M2 UND DES ERKANNTEN ANTIGENS IN
CD2-TRANSGENEN MAUS-T-ZELLEN 108
3. IN VITRO- AUSTESTUNG NEUER CD2 X EGF-R-BISPEZIFISCHER ANTIKOERPER 115
4. BEWERTUNG DER NEUEN CD2 X EGF-R-BISPEZIFISCHEN ANTIKOERPER IM
VERGLEICH ZU FRUEHER BESCHRIEBENEN KONJUGATEN 119
5. MOEGLICHE KONZEPTE ZUM EINSATZ CD2 X TUMORANTIGEN-BISPEZIFISCHER
ANTIKOERPER 123
V. LITERATUR 126
VI. ANHANG 137
1. ABKUERZUNGEN 137
2. DANKSAGUNG 140
3. LEBENSLAUF 141
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