Verbesserung der Acyloinkondensationsfähigkeit der Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis: eine strukturell-funktionale Analyse
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
ENZYME
IN
DER
ORGANISCHEN
SYNTHESE
.
1
1.2.
REAKTIONEN
THIAMINDIPHOSPHAT-ABHAENGIGER
ENZYME
.
2
1.3.
DIE
PHENYLACETYLCARBINOLSYNTHESE
.
4
1.4.
DIE
PYRUVATDECAIBOXYLASE
.
5
1.5.
DIE
CARBOLIGASEAKTIVITAET
DER
PDC
.
8
2.
ZIELSETZUNG
UND
STRATEGIE
.
11
3.
ENTWICKLUNG
EINES
EXPRESSIONSSYSTEMS
IN
E.
COLI
_
13
3.1.
KONSTRUKTION
DES
EXPRESSIONSVEKTORS
PPDC
.
13
3.2.
EXPRESSION
DER
WILDTYP
PDC
.
17
4.
UNGEZIELTE
MUTAGENESE
.
19
4.1.
DIE
POLYMERASEKETTENREAKTION
ALS
MITTEL
ZUR
UNGEZIELTEN
MUTAGENESE
.
19
4.2.
EXPRESSION
UND
SCREENING
DER
MUTANTEN
.
21
5.
PLANUNG
DER
GEZIELTEN
MUTAGENESE
.
22
5.1.
DIE
GEMEINSAME
STRUKTUR
DER
PYRUVATDECARBOXYLASE
UND
DER
PYRUVATOXIDASE
ALS
MODEU
.
22
5.2.
PLANUNG
VON
MUTATIONEN
IM
AKTIVEN
ZENTRUM
.
26
5.3.
UEBERLEGUNGEN
ZUR
MODIFIKATION
DES
SUBSTRATKANALS
.
27
5.4.
DIE
DOPPELMUTANTE
TRP392ALA
/
TYR481ASN
.
28
6.
DIE
KONSTRUKTION
DER
MUTANTEN
.
29
6.1.
MUTAGENESE
UND
KLONIERUNG
.
29
6.1.1.
DIE
MUTANTE
HFQ
.
30
6.1.2.
DIE
MUTANTE
EI
.
32
6.1.3.
DIE
MUTANTE
WA
.
33
6.1.4.
DIE
MUTANTE
WAYN
.
35
6.2.
EXPRESSION
DER
MUTANTEN
.
35
6.3.
AUFTEINIGUNG
DER
MUTANTEN
.
37
6.4.
DIE
HERSTELLUNG
VON
APOPROTEINEN
.
39
7.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MUTANTEN
.
41
7.1.
SPEZIFISCHE
AKTIVITAET
UND
KINETISCHE
KONSTANTEN
.
41
7.2.
DISSOZIATIONSVERHALTEN
UND
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
42
7.2.1.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
DER
HOLOENZYME
MITTELS
GELFILTRATION
.
42
7.2.2.
MOLEKULARGEWICHTSBESTUENMUNG
DER
APOPROTEINE
MITTELS
GELFILTRATION
.
42
7.2.3.
BESTIMMUNG
DES
DISSOZIATIONSVERHALTEN
DURCH
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
44
7.2.4.
DENATURIERUNG
DER
ENZYME
MITTELS
HARNSTOFF
.
45
7.3.
DIE
BINDUNG
VON
THIAMINDIPHOSPHAT
.
47
7.3.1.
AENDERUNG
DER
FLUORESZENZINTENSITAET
BEI
COFAKTORVERLUST
.
47
7.3.2.
BESTIMMUNG
DES
APPARENTEN
KO
S-WERTES
FILR
TDP
DER
MUTANTE
WA
.
48
7.4.
SUBSTRATSPEKTRUM
DER
DECATBOXYLIERUNGSREAKTION
DER
MUTANTE
WA
.
49
7.5.
STABILITAET
DER
MUTANTE
WA
BEI
37C
.
51
8.
DIE
ACYLOINKONDENSATION
.
52
8.1.
DIE
ACETOINSYNTHESE
.
52
8.1.1.
INAKTIVIERUNG
DURCH
ACETALDEHYD
.
53
8.2.
DIE
BENZOINSYNTHESE
.
54
8.3.
DIE
PAC-SYNTHESE
-
UNTERSUCHUNGEN
ZU
REAKTIONSBEDINGUNGEN
.
55
8.3.1.
DIE
PAC-SYNTHESE
DURCH
KONDENSATION
VON
ACETALDEHYD
UND
BENZALDEHYD.
.
55
8.3.2.
DIE
PAC-SYNTHESE
-
VARIATION
DER
PYRUVATKONZENTRATION
.
56
8.3.3.
DIE
PAC-SYNTHESE
-
VARIATION
DER
BENZALDEHYDKONZENTRATION
.
57
8.3.4.
BATCH-SYNTHESE
ZUR
PRODUKTION
VON
PAC
.
58
8.4.
PRAEPARATIVE
PAC-SYNTHESE
IM
GEKOPPELTEN
ENZYMATISCHEN
SYSTEM
.
59
8.5.
BESTIMMUNG
DES
ENANTIOMERENUEBERSCHUSSES
MITTELS
CHIRALER
GASCHROMATOGRAPHIE
.
63
8.6.
'H-NMR-UNTERSUCHUNGEN
.
64
9.
DISKUSSION
.
65
9.1.
EXPRESSION
DER
PDC
AUS
Z.MOBILIS
IN
COLI
.
65
9.2.
UNGEZIELTE
MUTAGENESE
ZUR
VERBESSERUNG
DER
PAC-SYNTHESE
.
66
9.3.
GEZIELTE
MUTAGENESE
ZUR
UNTERSUCHUNG
VON
STRUKTUR-FUNKTIONSBEZIEHUNGEN
.
69
9.3.1.
MUTATIONEN
DES
AKTIVEN
ZENTRUMS
-
DIE
MUTANTE
HFQ
.
71
9.3.2.
MUTATIONEN
DES
AKTIVEN
ZENTRUMS
DIE
MUTANTE
EI
.
73
9.3.3.
MUTATION
DES
MONOMERENKONTAKTS
-
DIE
MUTANTE
WAYN
.
74
9.3.4.
MUTATIONEN
AM
AKTIVEN
ZENTRUM
BZW.
AN
DER
MONOMERENKONTAKTFLAECHE
-
FAZIT
.
75
9.3.5.
MODIFIZIERUNG
DES
SUBSTRATKANALS
-
DIE
MUTANTE
WA
.
75
9.4.
DIE
ACYLOINKONDENSATION
.
77
9.4.1.
DIE
ACETOINSYNTHESE
.
77
9.4.2.
DIE
PAC-SYNTHESE
.
78
9.4.3.
NEBENPRODUKTE
DER
PAC-SYNTHESE
.
78
9.4.4.
PRAEPARATIVE
PAC-SYNTHESE
IM
GEKOPPELTEN
ENZYMATISCHEN
SYSTEM
.
79
10.
AUSBLICK
.
81
11.
ZUSAMMENFASSUNG
.
83
12.
METHODEN
.
86
12.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
86
12.1.1.
DNA-PRAEPARATION
.
86
12.1.2.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
86
12.1.3.
LIGATION
.
86
12.1.4.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E
CO/I-ZELLEN
.
87
12.1.5.
SYNTHESE
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
87
12.1.6.
SEQUENZIERUNG.
.
87
12.1.7.
UNGEZIELTE
MUTAGENESE.
.
88
12.1.8.
GEZIELTE
MUTAGENESE
.
88
12.2.
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
.
89
12.2.1.
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
.
89
12.2.2.
ZELLAUFCCHLUSS
.
89
12.2.3.
CHROMATOGRAPHISCHE
METHODEN
.
89
12.2.4.
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
90
12.2.5.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
90
12.2.6.
E
NTSALZUNG
UND
LYOPHILISATION
.
90
12.3.
PROTEINCHARAKTERISIERUNG
.
91
12.3.1.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION.
.
91
12.3.2.
BESTIMMUNG
DES
MOLEKULARGEWICHTS
MITTELS
GELFILTRATION
.
91
12.3.3.
DIE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
92
12.3.4.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
PROTEINE
(WESTERN
BLOT)
.
92
12.3.5.
ENZYMASSAY
.
93
12.3.6.
BESTIMMUNG
DES
KO
5-WERTES
FUER
TDP
.
93
12.3.7.
BESTIMMUNG
DER
RESTAKTIVITAETEN
DER
MUTANTEN
HFQ
UND
WAYN
.
93
12.3.8.
UNTERSUCHUNG
DES
SUBSTRATSPEKTRUMS
DER
DECARBOXYLIERUNGSREAKTION
DER
MUTANTE
WA
.
94
12.3.9.
UNTERSUCHUNG
DER
STABILITAET
DER
MUTANTE
WA
BEI
37C
.
94
12.3.10.
INAKTIVIERUNGSSTUDIEN
DURCH
ACETALDEHYD
.
94
11.3.11.
HARNSTOFIVERMITTELTE
PROTEINDENATURIERUNG
.
95
12.3.12.
AENDERUNG
DER
FLUORESZENZINTENSITAET
DURCH
COLAEKTORDISSOZIATION
.
95
12.4.
ANALYTIK
ZUR
ACYLOINKONDENSATION
.
96
12.4.1.
ACETOINNACHWEIS
-
DIE
VOGES-PROSKAUER-REAKTION
.
96
12.4.2.
ACETOINNACHWEIS
ENZYMATISCHER
REAKTIONSANSATZE
.
96
12.4.3.
ISOLIERUNG
DES
PAC
AUS
ROHKETOL
.
98
12.4.4.
PAC-ANALYTIK
MITTELS
REVERSED
PHASE
HPLC
.
100
12.4.5.
ISOLIERUNG
DES
PAC
AUS
DEM
ENZYMATISCHEN
REAKTIONSANSATZ
.
101
12.4.6.
DURCHFUEHRUNG
DER
ENZYMATISCHEN
ACYLOINKONDENSATIONEN
.
101
12.4.7.
DIE
BENZOINSYNTHESE
.
101
12.4.8.
DIE
PAC-SYNTHESE
AUSGEHEND
VON
ACETALDEHYD
.
101
12.4.9.
DIE
PAC-SYNTHESE
-
VARIATION
DER
PYRUVATKONZENTRATION
.
102
12.4.10.
DIE
PAC-SYNTHESE
-
VARIATION
DER
BENZALDEHYDKONZENTRATION
.
102
12.4.11.
OPTIMIERTE
PAC-SYNTHESE
IM
BATCH-ANSATZ
.
103
12.4.12.
PRAEPARATIVE
PAC-SYNTHESE
IM
GEKOPPELTEN
ENZYMATISCHEN
SYSTEM.
103
12.4.13.
BESTIMMUNG
DES
PAC-ENANTIOMERENUEBERSCHUSSES
MITTELS
CHIRALER
GC
.
104
12.4.14.
IDENTIFIZIERUNG
DES
PAC
UND
DES
2-HYDROXYPROPIOPHENONS
MITTELS
NMR
.
104
12.5.
COMPUTERGESTUETZTE
METHODEN
.
104
12.5.1.
PLANUNG
DER
GEZIELTEN
MUTATIONEN
.
104
13.
MATERIAL
.
106
14.
LITERATUR
_
_
.
_._
._
_110
ANHANG
.118 |
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