Hochsensitive Zytokin-mRNA-Quantifizierung mit der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR):
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I
.
EINLEITUNG
1
1.
RELEVANZ
DER
ZYTOKIN-MRNA-QUANTIFIZIERUNG
FUER
DIE
1
ERFORSCHUNG
DER
HAEMATOPOESE-REGULATION
UND
IHRER
ER
KRANKUNGEN
2.
BESCHREIBUNG
DER
METHODE
"QUANTITATIVE
PCR"
3
3.
BEDEUTUNG
DER
CSFS
FUER
DIE
HAEMATOPOESE-REGULATION
5
UND
DIE
FUNKTION
REIFER
ZELLEN
3.1.
CSF-EXPRESSION
UND
IHRE
REGULATION
6
3.1.1.
PRODUKTIONSORTE
DER
CSFS
6
3.1.2.
EXPRESSIONSINDUKTION
DER
CSFS
7
3.1.3.
INTRAZELLULAERE
EXPRESSIONSKONTROLL-VORGAENGE
9
3.1.4.
NEGATIVE
RUECKKOPPLUNG
ZUR
KONTROLLE
DER
CSFS
IC
3.2.
CSF-WIRKUNG
1C
3.2.1.
EFFEKTOR-ZELLEN
DER
CSFS
IC
3.2.2.
SIGNALTRANSDUKTION
12
3.3.
MOLEKULARBIOLOGIE
DER
CSFS
UND
IHRER
REZEPTOREN
13
4.
MEDIZINISCHE
ASPEKTE
DER
CSFS
17
4.1-.
BEDEUTUNG
DER
CSFS
FUER
DIE
ENTSTEHUNG
UND
THERAPIE
17
VON
ERKRANKUNGEN
4.1.1.
CSFS
BEI
DER
PATHOGENESE
17
4.1.2.
THERAPEUTISCHE
BEDEUTUNG
DER
CSFS
17
4.2.
BEDEUTUNG
DER
CSFS
BEI
SPEZIELLEN
ERKRANKUNGEN
19
4.2.1.
CSFS
BEI
HAEMATOPOETISCHEN
SYSTEMERKRANKUNGEN
19
4.2.1.1.
EXPERIMENTELLE
LEUKAEMOGENESE-MODELLE
21
4.2.1.2.
ZYTOGENETISCHE
VERAENDERUNGEN
21
4.2.1.3.
FUNKTIONELLE
UND
QUANTITATIVE
VERAENDERUNGEN
24
DER
CSFS,
IHRER
REZEPTOREN
UND
SIGNALUEBERTRA
GUNGSWEGE
4.2.2.
CSFS
BEI
NEUTROPENIEN
26
4.2.2.1.
KOSTMANN-SYNDROM
26
4.2.2.2.
CHRONISCHE
IDIOPATHISCHE
NEUTROPENIE
29
4.2.2.3.
ZYKLISCHE
NEUTROPENIE
30
4.2.3.
TURNER-SYNDROM
3
3
II.
AUFGABENSTELLUNG
35
1.
ANWENDUNG
DER
BEREITS
ETABLIERTEN
QUANTIFIZIERENDEN
35
G-CSF-PCR
2.
KONSTRUKTION
INTERNER
PCR-STANDARDS
MIT
EINER
EIN
35
FACHEN
UND
FUER
JEDE
BEKANNTE
SEQUENZ
DURCHFUEHRBAREN
METHODE,
ETABLIERUNG
UND
ANWENDUNG
EINER
QUANTIFI
ZIERENDEN
GM-CSF-PCR
ALS
BEISPIEL
3.
PCR-GESTEUERTE
MRNA-BESTIMMUNG
MIT
SEHR
GERINGEN
35
RNA-MENGEN:
EXPRESSIONSNACHWEIS
EINES
KONSTITUTIV
EXPRIMIERTEN
GENS
ALS
KONTROLLE
III.
MATERIAL
UND
METHODEN
37
0.
ABKUERZUNGEN
37
1.
MATERIAL
40
2.
METHODEN
ZUR
ZELLSEPARIERUNG,
KULTUR
UND
CHARAKTE
47
RISIERUNG
2.1.
KULTIVIERUNG
DER
ZELLINIE
5637
47
2.2.
ISOLIERUNG
VON
GRANULOZYTEN
AUS
BUFFY-COAT-BLUT
47
2.3.
ISOLIERUNG
VON
LYMPHOZYTEN
AUS
PBMC
(LME-LYSE
DER
48
MONOZYTEN)
2.4.
ISOLIERUNG
VON
MONOZYTEN
DURCH
ADHAERENZ
48
2.5.
ZELLKULTUR
VON
PBMC,
LYMPHOZYTEN
UND
ADHAERENTEN
49
MONOZYTEN
2.6.
CHARAKTERISIERUNG
ISOLIERTER
BLUTZELLEN
49
2.6.1.
DIFFERENZIERUNG
VON
LEUKOZYTEN
NACH
MORPHOLO
49
GISCHEN
KRITERIEN:
MODIFIZIERTE
WRIGHT-FAERBUNG
2.6.2.
ZYTOCHEMISCHE
METHODE
ZUR
FAERBUNG
VON
MONOZYTEN:
50
NICHT-SPEZIFISCHE
ESTERASE-FAERBUNG
2.6.3.
IMMUNOLOGISCHE
DIFFERENZIERUNG:
FACSCAN-ANALYSE
50
NACH
ANTIKOERPERFAERBUNG
3.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
52
3.1.
ALLGEMEINE
METHODEN
ZUR
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEURE
52
3.1.1.
DEPROTEINIERUNG
DURCH
PHENOLEXTRAKTION
52
3.1.2.
PRAEZIPITATION
53
3.1.3.
RNASE-SCHUTZ
BEI
RNA-ISOLIERUNG
UND
BEARBEITUNG
54
3.1.4.
AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE
ZUR
ENTFERNUNG
VON
NUK
54
LEOTIDEN
UND
SALZEN
3.2.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
55
3.2.1.
PHOTOMETRISCHE
METHODE
55
3.2.2.
FLUORESZENZMETHODE
56
3.3.
GEL-ELEKTROPHORESE
ZUR
GROESSENFRAKTIONIERUNG
UND
57
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
3.3.1.
ANALYTISCHE
UND
PRAEPARATIVE
DNA-AGAROSE-GELE
57
3.3.2.
RNA-FORMALDEHYD-AGAROSE-GELE
58
3.3.3.
DENATURIERENDE
PAA-GELE
ZUR
DNA-SEQUENZIERUNG
59
3.3.4.
PRAEPARATIVE
DENATURIERENDE
PAA-GELE
ZUR
REINI
61
GUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
3.4.
ISOLIERUNG
VON
DNA
UND
OLIGONUKLEOTIDEN
AUS
GELEN
61
3.4.1.
DEAE-ZELLULOSE-METHODE
FUER
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
61
3.4.2.
GENECLEAN-METHODE
FUER
DNA
AUS
AGAROSE-GELEN
62
3.4.3.
OLIGONUKLEOTID-ISOLIERUNG
AUS
PAA-GELEN
63
3.5.
VERMEHRUNG
VON
PLASMIDEN
IN
BAKTERIEN
63
3.5.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
64
3.5.2.
TRANSFORMATION
65
3.6.
PLASMIDISOLATION
AUS
BAKTERIEN
66
3.5.1.
MINI-PLASMID-PRAEPARATION
66
3.5.2.
MIDI-PLASMID-PRAEPARATION
68
3.7.
ENZYMATISCHE
BEARBEITUNG
VON
DNA
69
3.7.1.
SEGUENZSPEZIFISCHE
SPALTUNG
(RESTRIKTIONSENZYME)
69
3.7.2.
GLAETTUNG
UEBERSTEHENDER
EINZELSTRAENGIGER
ENDEN
70
(KLENOW-ENZYM)
3.7.3.
LIGATION
(T4-DNA-LIGASE)
70
3.8.
RNA-ISOLIERUNG
71
3.8.1.
GUANIDINIUMCHLORID-CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIEN
71
TEN-METHODE
3.8.2.
"ACID
GUANIDINIUM
PHENOL
CHLOROFORME"
(AGPC)
-
73
METHODE
3.8.3.
ISOLIERUNG
ZYTOPLASMATISCHER
RNA
73
3.9.
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
FUER
PCR
74
3.10.
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
75
3.10.1.
SYNTHESE
75
3.10.2.
REINIGUNG
75
3.11.
UEBERTRAGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
NYLON-FILTER
76
(NORTHERN
BLOT)
3.12.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
77
3.13.
FILTERHYBRIDISIERUNG
ZUM
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
78
NUKLEINSAEUREN
3.14.
DNA-SEQUENZIERUNG
81
3.15.
REVERSE
TRANSKRIPTION
83
3.16.
PCR
84
3.16.1.
ALLGEMEINE
REAKTIONSBEDINGUNGEN
84
3.16.2.
DARSTELLUNG
DER
PCR-PRODUKTE
87
3.16.3.
G-CSF-PCR
90
IV.
DURCHFUEHRUNG
UND
ERGEBNISSE
93
1.
ETABLIERUNG
EINER
PCR
FUER
GM-CSF
93
1.1.
PRIMER-AUSWAHL
UND
HERSTELLUNG
93
1.2.
BEREITSTELLUNG
UND
UEBERPRUEFUNG
DES
PGEM-2-GM-CSF
95
DURCH
SEQUENZIERUNG
1.3.
OPTIMIERUNG
DER
REAKTIONSBEDINGUNGEN
DER
GM-CSF
96
PCR
1.4.
PROBE-PCR
MIT
GENOMISCHER
DNA
97
1.5.
PROBE-PCR
MIT
CDNA
DER
ZELLINIE
5637
97
1.6.
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
PCR-FRAGMENTES
DER
98
CDNA-PCR
UND
HERSTELLUNG
EINES
INTERNEN
STANDARDS
FUER
DIE
GM-CSF-PCR
(GM-S)
1.6.1.
VORUEBERLEGUNGEN
98
1.6.2.
KLONIERUNG
DES
PCR-MATERIALS
98
1.6.3.
SEQUENZIERUNG
100
1.7.
EIGNUNGSTESTUNG
DES
GM-S
ALS
QUANTIFIZIERUNGSSTAN
101
DARD
1.7.1.
MISCHUNGSVERHAELTNISSE
(GM-CSF
UND
GM-S)
101
1.7.2.
VERFOLGUNG
DES
VERLAUFS
DER
PCR
103
2.
ETABLIERUNG
EINER
ALDOLASE-A-PCR
104
2.1.
VORUEBERLEGUNGEN
ZUR
AUSWAHL
DER
ALDOLASE
A
104
2.1.1.
ALLGEMEINE
VORAUSSETZUNGEN
FUER
DIE
AUSWAHL
EINES
104
KONSTITUTIV
EXPRIMIERTEN
GENS
FUER
DIE
PCR
2.1.2.
VORINFORMATION
UEBER
DAS
ENZYM
FRUKTOSE-1,6-DI
106
PHOSPHAT-ALDOLASE
2.1.3.
EINGRENZUNG
DER
AUSWAHL
AUF
DIE
H-TYP-MRNA
VON
108
ALDOLASE
A
2.2.
AUSWAHL
UND
HERSTELLUNG
DER
PRIMER
109
2.3.
KLONIERUNG
DES
ALDOLASE-A-PCR-FRAGMENTES
UND
HER
110
STELLUNG
EINES
INTERNEN
STANDARDS
(A-S)
,
UEBERPRUE
FUNG
DER
SPEZIFITAET
2.3.1.
KLONIERUNG
DES
PCR-MATERIALS
110
2.3.2.
SEQUENZ
IERUNG
111
2.4.
OPTIMIERUNG
DER
REAKTIONSBEDINGUNGEN
112
2.5.
PROBE-PCR
MIT
GENOMISCHER
DNA
113
2.6.
EIGNUNGSTESTUNG
DES
A-S
ALS
QUANTIFIZIERUNGSSTAN
114
DARD
2.6.1.
MISCHUNGSVERHAELTNISSE
(AID
UND
A-S)
114
2.6.2.
VERFOLGUNG
DES
VERLAUFS
DER
PCR
115
3.
KOMBINIERTE
PCRS
(ALDOLASE
A,
G
UND
GM-CSF)
116
3.1.
KOMBINATIONEN
DER
PLASMIDE
MIT
DEN
VERSCHIEDENEN
116
INSERTS:
UNTERSUCHUNG
AUF
QUANTITATIVE
VERSCHIE
BUNGEN
DURCH
DIE
PCR
3.1.1.
KOMBINATION
ALLER
3
PLASMID-PCRS
116
3.1.2.
UNTERSUCHUNG
DER
KOMBINIERTEN
PLASMID-PCRS
MIT
117
UNTERSCHIEDLICHEN
MISCHUNGSVERHAELTNISSEN
3.1.3.
VERFOLGUNG
DES
VERLAUFS
VON
KOMBINIERTEN
PIAS
119
MID-PCRS
3.2.
KOMBINATIONS-PCRS
MIT
CDNA
121
3.2.1.
KOMBINIERTE
UND
GETRENNTE
RTK-REAKTIONEN
121
3.2.2.
KOMBINIERTE
UND
GETRENNTE
PCRS
122
4.
NACHWEISGRENZEN
124
4.1.
PLASMID-PCRS
124
4.2.
INTERNE
STANDARDS
(PLASMIDE
MIT
G-S,
GM-S
UND
A-S)
126
5.
ALDOLASE
A,
G-CSF
UND
GM-CSF-MRNA-QUANTIFIZIERUNG
131
IN
5637
5.1.
VERGLEICHENDE
MESSUNG
NACH
EINFACH
BZW.
DREIFACH
131
SPEZIFISCHER
REVERSER
TRANSKRIPTION
5.2.
VERGLEICHENDE
MESSUNG
NACH
VERSCHIEDENEN
RNA-PRAE
135
PARAT
IONSMETHODEN
6.
UEBERPRUEFUNG
DER
ALDOLASE-A-EXPRESSION
ALS
MASS
FUER
137
DIE
RNA-MENGE
6.1.
KULTIVIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZELLEN,
137
RNA-ISOLIERUNG
6.2.
NORTHERN
BLOT,
QUANTITATIVE
AUSWERTUNG
138
7.
QUANTIFIZIERUNG
DURCH
KOAMPLIFIZIERENDE
PCRS:
RNA
140
VERSCHIEDENER
ZELLINIEN
UND
LEUKOZYTEN
7.1.
ZELLINIEN-RNA
141
7.2.
PBMC-RNA
143
7.2.1.
GTC-CSCL-RNA
143
7.2.2.
ZYTOPLASMATISCHE
RNA
147
7.3.
LYMPHOZYTEN-RNA
148
7.4.
GRANULOZYTEN-RNA
150
7.5.
RNA
ADHAERENTER,
UNSTIMULIERTER
MONOZYTEN
151
V.
DISKUSSION
153
1.
ZUSAMMENFASSENDE
INTERPRETATION
DER
ERGEBNISSE
153
1.1.
ANWENDUNG
DER
BEREITS
ETABLIERTEN
QUANTIFIZIEREN
153
DEN
G-CSF-PCR
1.2.
ETABLIERUNG
EINER
QUANTIFIZIERENDEN
GM-CSF-PCR
MIT
156
EINER
NEUEN
METHODISCHEN
VARIANTE
DER
"KOMPETITI
VEN
RT-PCR"
UND
IHRE
ANWENDUNG
1.3.
PCR-GESTEUERTE
MRNA-QUANTIFIZIERUNG
MIT
SEHR
GE
158
RINGEN
RNA-MENGEN,
ETABLIERUNG
UND
ANWENDUNG
EINER
QUANTITATIVEN
ALDOLASE-A-PCR
2.
VORTEILE
DER
ETABLIERTEN
KOMPETITIVEN
RT-PCR
ZUR
162
MRNA-QUANTIFIZIERUNG
3.
METHODISCHE
PROBLEME
UND
LOESUNGSMOEGLICHKEITEN
163
3.1.
ZELLISOLIERUNG,
ZELLKULTUREN
UND
RNA-GEWINNUNG
163
3.2.
REVERSE
TRANSKRIPTION
165
3.3.
PCR
167
4.
ANWENDUNGS
UND
ERWEITERUNGSMOEGLICHKEITEN
DER
TECH
170
NIK
VI.
ZUSAMMENFASSUNG
174
VII.
LITERATURVERZEICHNIS
176 |
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