Charakterisierung der Nukleotidbindungsplätze der H + -ATPase aus Chloroplasten:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ZUSAMMENFASSUNG
10
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
12
1
EINLEITUNG
14
1.1
STRUKTUR
DER
H
+
-ATPASE
15
1.2
NUKLEOTIDBINDUNGSPLAETZE
19
1.3
ANZAHL
DER
INTERAGIERENDEN
KATALYTISCHEN
BINDUNGSPLAETZE
21
1.4
KOPPLUNG
ZWISCHEN
PROTONENTRANSLOKATION
UND
ATP-SYNTHESE
22
1.5
UNI
UND
MULTI-SITE
KATALYSE
23
1.6
AKTIVIERUNG
UND
REGULATION
DER
H
+
-ATPASE
AUS
CHLOROPLASTEN
24
1.7
PHOTOAKTIVIERBARE
NUKLEOTIDANALOGA
25
1.8
ZIEL
DER
ARBEIT
27
2
MATERIAL
UND
METHODEN
29
2.1
CHEMIKALIENLISTE
29
2.2
ISOLIERUNG
DER
H
+
-ATPASE
AUS
SPINATCHLOROPLASTEN
30
2.3
PROTEINBESTIMMUNG
32
-4
2.4
REKONSTITUTION
DER
H
+
-ATPASE
IN
VORGEFORMTE
LIPOSOMEN
32
2.5
TRENNUNG
DER
FREIEN
NUKLEOTIDE
VON
CF
O
F,
AUF
G-50
ZENTRIFUGATIONSSAEULEN
33
2.6
BESTIMMUNG
DER
FREIEN
UND
GEBUNDENEN
NUKLEOTIDE
34
2.7
SYNTHESE
VON
2N
3
-[A
32
P]-AT(D)P
35
2.7.1
SYNTHESE
VON
2-AZIDOADENOSIN
35
2.7.2
SYNTHESE
VON
2
'
,
3
'
-O-ISOPROPYLIDEN-2-AZIDOADENOSIN
37
2.7.3
SYNTHESE
VON
2N
3
-[A
32
P]-AMP
38
2.7.4
PHOSPHORYLIERUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-AMP
IN
2N
3
-[A
32
P]AD(T)P
40
2.7.5
REINIGUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-ADP
UND
-ATP
UEBER
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
42
2.7.6
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
DER
SPEZIFISCHEN
AKTIVITAET
BEIDER
PRODUKTE
44
2.7.7
DARSTELLUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-ADP
AUS
2N
3
-[A
32
P]-ATP
44
2.8
INKUBATION
MIT
2N
3
-[A
32
P]-AD(T)P.
BESTIMMUNG
DES
GEBUNDENEN
2N
3
-[A
32
P]-AD(T)P-ANTEILS
45
2.9
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
45
2.10
BESTIMMUNG
DES
KOVALENT
GEBUNDENEN
ANTEILS
AN
2N
3
-[A
32
P]-AT(D)P
46
2.11
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
47
2.11.1
TRYPSINIERUNG
DES
MARKIERTEN
ENZYMS
47
2.11.2
HPLC-REINIGUNG
DER
MARKIERTEN
PEPTIDSEQUENZEN
47
2.12
MESSUNG
DER
ATP-SYNTHESE
48
2.12.1
MESSUNG
DER
ATP-SYNTHESE
MIT
DER
TWO-STEP
METHODE
48
2.12.2
MESSUNG
DER
ATP-SYNTHESE
MIT
DER
ONE-STEP
METHODE
50
2.12.3
MESSUNG
DER
ATP-SYNTHESEGESCHWINDIGKEIT
AN
GEWASCHENEN
THYLAKOIDE
IM
DAUERLICHT
MIT
2N
3
-ADP
ALS
SUBSTRAT
50
2.12.4
BESTIMMUNG
DES
GEBILDETEN
2N
3
-[
T
32
P]-ATP
51
-5
-
2.13
MESSUNG
DER
ATP-HYDROLYSE
53
2.13.1
MESSUNG
DER
ATP-HYDROLYSE
MIT
[Y
32
P]-ATP
53
2.13.2
TRENNUNG
VON
32
P,
UND
[Y
32
P]-ATP
DURCH
EXTRAKTION
54
2.13.3
MESSUNG
DER
ATP-HYDROLYSE
MIT
DER
ONE-STEP
METHODE
55
2.14
BESTIMMUNG
DER
IM
APH/AI'-SPRUNG
FREIGESETZTEN
2N
3
-[A
32
P]
NUKLEOTIDE
55
3
ERGEBNISSE
57
3.1
MESSUNG
DER
ATP-SYNTHESEGESCHWINDIGKEIT
AN
THYLAKOIDEN
IM
DAUER!
ICHT
ALS
FUNKTION
DER
2N
3
-ADP
KONZENTRATION
57
3.2
INKUBATION
DES
ISOLIERTEN
CF
F
FI
MIT
2N
3
-[A
32
P]-ATP
UND
-ADP
IN
ANWESENHEIT
VON
EDTA
UNG
MGCL
2
59
3.2.1
INKUBATION
DES
UNBEHANDELTEN
CF
0
F,
59
3.2.1.1
INKUBATION
IN
ANWESENHEIT
VON
2
MM
EDTA
59
3.2.1.2
INKUBATION
IN
ANWESENHEIT
VON
2
MM
MGCL
2
62
3.2.2
INKUBATION
DES
VORBEHANDELTEN
CF
0
F
1
65
3.2.2.1
INKUBATION
DES
VORBEHANDELTEN
CF
0
FJ
MIT
2N
3
-[A
32
P]-ATP
UND
MGCL
2
66
3.2.2.2
INKUBATION
DES
VORBEHANDELTEN
CF
0
F,
MIT
2N
3
-[A
32
P]-ADP
UND
MGCL
2
69
3.2.3
DIE
INKUBATIONSVERFAHREN
70
3.2.3.1
HERLEITUNG
VERSCHIEDENER
INKUBATIONSVERFAHREN
70
3.2.3.2
INHOMOGENE
BESETZUNG
DER
BINDUNGSPLAETZE
IN
DEN
VERFAHREN
1-4
WENN
IN
GEGENWART
VON
2N
3
-[A
32
P]-ATP
INKUBIERT
WIRD
75
3.2.3.3
ALLGEMEINES
ZU
DEN
VERFAHREN
79
3.3
BESETZUNG
DES
2.
KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(K2).
VERFAHREN
1
82
3.3.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
83
3.3.1.1
NUKLEOTID
UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
83
3.3.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
84
3.3.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
89
3.3.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
89
-6
3.3.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
92
3.3.2.3
MESSUNG
DER
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
96
3.3.2.4
BESTIMMUNG
DER
IM
APH/A'J'-SPRUNG
FREIGESETZTEN
2N
3
-[A
32
P]-AXP
99
3.4
BESETZUNG
DES
2.
KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(K2).
VERFAHREN
2
100
3.4.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
100
3.4.1.1
NUKLEOTID-UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
100
3.4.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
102
3.4.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
103
3.4.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
103
3.4.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
104
3.4.2.3
MESSUNG
DER
ATP-HYDROLYSE
BEI
1
MM
ATP
107
3.4.2.4
BESTIMMUNG
DER
IM
APH/A'J'-SPRUNG
FREIGESETZTEN
2N
3
-[A
32
P]-AXP
108
3.5
BESETZUNG
DES
1.
UND
2.
KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(KL
+K2).
VERFAHREN
3
109
3.5.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
110
3.5.1.1
NUKLEOTID-UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
110
3.5.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
111
3.5.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
112
3.5.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
112
3.5.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
113
3.5.2.3
MESSUNG
DER
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
115
3.6
BESETZUNG
DES
1.
KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(KL).
VERFAHREN
4
119
3.6.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
120
3.6.1.1
NUKLEOTID-UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
120
3.6.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
121
3.6.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
124
3.3.2.1
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
124
3.6.2.2
DIE
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
126
3.6.2.3
BESTIMMUNG
DER
IM
APH/A
'
J'-SPRUNG
FREIGESETZTEN
2N
3
-[A
32
P]-AXP
129
-
7
-
3.7
BESETZUNG
DES
3.
KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(K3).
VEFAHREN
5
130
3.7.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
131
3.7.1.1
NUKLEOTID
UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
131
3.7.1.2
ANALYSE
DER
MARKIERTEN
PEPTIDE
133
3.7.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
139
3.7.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
139
3.7.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
140
3.7.2.3
DIE
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
142
3.7.2.4
BESTIMMUNG
DER
IM
APH/A'F-SPRUNG
FIREIGESETZTEN
2N
3
-[A
32
P]-AXP
144
3.8
BESETZUNG
DES
2.
UND
3.
NICHT-KATALYTISCHEN
BINDUNGSPLATZES
(NK2+NK3).
VERFAHREN
6
146
3.8.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
147
3.8.1.1
NUKLEOTID
UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
147
3.8.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
PJ-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
148
3.8.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
152
3.8.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
152
3.8.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
153
3.8.2.3
DIE
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
155
3.8.2.4
FREISETZUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-AXP
IM
APH/A'P-SPRUNG
157
3.9
BESETZUNG
2.
NICHT-KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(NK2).
VERFAHREN
7
158
3.9.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
159
3.9.1.1
NUKLEOTID
UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
159
3.9.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
160
3.9.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
163
3.9.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
163
3.9.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
164
3.9.2.3
DIE
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
166
3.9.2.4
FREISETZUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-AXP
IM
APH/A'P-SPRUNG
169
-
8
-
3.10
BESETZUNG
3.
NICHT-KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(NK3).
VERFAHREN
8
170
3.10.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
171
3.10.1.1
NUKLEOTID
UND
2N
3
-[A
32
P|-AXP-GEHALT
171
3.10.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
172
3.10.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
174
3.10.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
174
3.10.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
176
3.10.2.3
DIE
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
178
3.10.2.4
FREISETZUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-AXP
IM
APH/A'F-SPRUNG
180
3.11
BESETZUNG
1.
NICHT-KATALYTISCHEN
NUKLEOTIDBINDUNGSPLATZES
(NKL).
VERFAHREN
9
181
3.11.1
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
183
3.11.1.1
NUKLEOTID-UND
2N
3
-[A
32
P]-AXP-GEHALT
183
3.11.1.2
ANALYSE
DER
2N
3
-[A
32
P]-AXP
MARKIERTEN
PEPTIDE
184
3.11.2
KINETISCHE
CHARAKTERISIERUNG
187
3.11.2.1
EINFLUSS
DER
BELICHTUNG
AUF
DIE
ATP-SYNTHESE
187
3.11.2.2
DIE
ATP-SYNTHESE
ALS
FUNKTION
DER
ADP
KONZENTRATION
189
3.11.2.3
DIE
ATP-HYDROLYSE
ALS
FUNKTION
DER
ATP
KONZENTRATION
191
3.11.2.4
FREISETZUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-AXP
IM
APH/A'F-SPRUNG
193
4
DISKUSSION
194
4.1
BESETZUNG
UND
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
DER
NUKLEOTIDBINDUNGSPLAETZE
194
4.1.1
2N
3
-ADENINNUKLEOTIDE
194
4.1.2
DIE
VERFAHREN
195
4.2
DIE
NUKLEOTIDBINDUNGSPLAETZE
200
4.2.1
DIE
REIHENFOLGE
DER
NUKLEOTIDBINDUNG
200
4.2.2
BESETZUNGSMUSTER
NACH
DER
REKONSTITUTION
207
4.2.3
STRUKTUR
DER
NUKLEOTIDBINDUNGSPLAETZE
209
4.2.4
BESCHREIBUNG
DER
NUKLEOTIDBINDUNGSPLAETZE
IN
DER
LITERATUR
212
-9
4.3
FREISETZUNG
VON
2N
3
-[A
32
P]-AXP
IM
APH/A'P-SPRUNG
217
4.4
DIE
KINETIK
220
4.4.1
DIE
ATP-SYNTHESE
220
4.4.2
DIE
ATP-HYDROLYSE
227
4.4.3
VERGLEICH
MIT
DER
LITERATUR
232
4.5
MECHANISMUS
DER
ATP-SYNTHESE/-HYDROLYSE
235
LITERATURVERZEICHNIS
241
DANKSAGUNG
250
LEBENSLAUF
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